[發明專利]靶向人CD19抗原的人源化單克隆抗體

有效

• 申請號: 201710301492.1
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107312091B
• 公開（公告）日: 2019-10-22
• 發明（設計）人: 張巍
• 申請（專利權）人: 重慶精準生物技術有限公司
• 主分類號: C07K16/28
• 分類號: C07K16/28;C07K19/00;C12N15/867;C12N5/10;A61K35/17;A61P35/00;A61P35/02
• 代理公司: 北京元本知識產權代理事務所 11308
• 代理人: 黎昌莉

本發明公開了一種靶向人CD19抗原的人源化單克隆抗體，并將其應用于嵌合抗原受體T細胞的構建與制備，而后在體外實驗中驗證了嵌合抗原受體T細胞腫瘤治療效果。靶向人CD19抗原的嵌合抗原受體由前導肽、靶向人CD19抗原的單鏈抗體、連接ScFv所用的鉸鏈區、跨膜結構域和免疫受體酪氨酸活化基序組成，將該嵌合抗原受體構建成慢病毒表達載體，然后感染免疫細胞，能夠在免疫細胞表達靶向人CD19抗原的嵌合抗原受體，通過識別腫瘤細胞表面的CD19抗原，從而殺死表達CD19抗原的腫瘤，實現腫瘤治療目的，為腫瘤靶向治療提供了新的工具。

技術領域

本發明屬于生物領域，具體涉及抗人CD19抗原人源化單克隆抗體設計，還涉及表達靶向人CD19抗原的嵌合抗原受體的慢病毒表達載體，以及慢病毒表達載體的制備方法和應用。

背景技術

單克隆抗體的產生技術經歷了三個階段：經典免疫方法產生的異源多克隆抗體；細胞工程產生的鼠源單克隆抗體及基因工程產生的人源單克隆抗體。將針對某一腫瘤抗原的單克隆抗體與化療藥物或放療物質聯合，利用單克隆抗體的導向作用，將藥物或放療物質攜帶至靶器官，直接殺傷靶細胞，稱為腫瘤導向治療。另外，將放射性標記物與單克隆抗體連接，注入患者體內可進行放射免疫顯像，協助腫瘤的診斷。以小鼠來源單克隆抗體用于疾病治療，直接使用小鼠抗體進行人體治療時，因為鼠抗的異質性會引起人抗鼠抗體反應(Human anti-mouse antibody reaction，HAMA)，導致抗體半衰期短，在循環系統中被很快清除，失去療效。因此，治療用鼠源單抗需要進行人源化修飾以提高抗體的人源化程度、減弱HAMA。人源化抗體就是指抗體的可變區部分(即VH和VL區)或抗體全部由人類抗體基因所編碼。人源化抗體可以大大減少異源抗體對人類機體造成的免疫副反應，人源化抗體的形式也從最初的嵌合抗體、改型抗體等逐步發展為人源化抗體。

將鼠源抗體改造為人源化抗體有以下幾種主要形式：鼠可變區(Viarableregion，VRs)+人恒定區(Constant region，CRs)、鼠互補決定區(Complementaritydetermining region，CDRs)+人框架區(Fragment regions，FRs)、鼠CDRs+人FRs等，尤其以“鼠CDRs+人FR”模式最為常見，這種人源化抗體形式僅僅保留了CDRs中的鼠源殘基，而將其余部分替換為人抗殘基，能將鼠抗的異源反應降到較低水平。但是直接將鼠抗CDRs移入人抗FRs通常會導致抗體失去原有抗原結合活性，因此需要對影響抗原抗體結合的關鍵殘基進行反復修改，而后通過大量抗原抗體結合特異性、親和力檢測，從而篩選得到具有活性的抗體序列。傳統人源化改造方案大多基于小鼠抗體與人抗體的序列同源性分析。

過繼細胞治療(Adoptive cell therapy，ACT)是生物治療技術的一種，通過對自體免疫細胞(主要是T細胞)進行體外擴增，然后將其回輸給腫瘤患者以達到治療目的的方法，被認為是繼手術、放、化療后的第4種癌癥治療方式，在臨床治療中受到廣泛應用。過繼細胞治療技術主要包括：淋巴因子活化的殺傷細胞(Lymphokine activated killer cell，LAK)與IL-2聯合治療晚期惡性腫瘤取得了一定療效；腫瘤浸潤淋巴細胞(Tumorinfiltrating lymphocytes，TIL)，治療轉移性黑色素瘤取得了較好的臨床效果；細胞因子誘導的殺傷細胞(Cytokine induced killer cell，CIK)對肝癌、肺癌等腫瘤取得了顯著的效果。但是目前上述三種治療方法均需活化T細胞。T細胞活化需要兩種活化信號，即T細胞表面的TCR-CD3與MHC-I分子結合產生活化的第一信號，決定T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性；T細胞表面的共刺激分子與相應配體結合產生活化的第二信號，決定T細胞增殖。但腫瘤細胞在腫瘤微環境中可下調自身MHC、配體分子的表達，從而抑制T細胞對腫瘤細胞的殺傷活性。因此需要對T細胞進行基因改造，使其重新獲得對腫瘤細胞的殺傷能力。目前這種改造主要有兩種方式：基因轉導TCR(T cell receptor，TCR)和嵌合抗原受體(Chimericantigen receptor，CAR)。