[發明專利]一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201710301443.8
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN107064501B
• 公開（公告）日: 2019-04-16
• 發明（設計）人: 楊順利;尹雙輝;尚佑軍;袁莉;吳錦艷;蔡建平;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/543;G01N33/577;G01N21/31;G01N21/78
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 張克勤

1.一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：將特異性鑒定和篩選來自豬瘟病毒疫苗株C-株編碼的E2蛋白兩個重復的抗原結構域A通過柔性氨基酸接頭、半胱氨酸、疏水氨基酸進行融合串聯，并在大腸桿菌E.coli中成功獲得重組表達蛋白，重組蛋白命名為r2E2，以其作為抗原建立的定量檢測抗豬瘟病毒E2蛋白IgG抗體競爭ELISA試劑盒；

柔性接頭的編碼氨基酸為GGGGSGGGGS；

試劑盒包括抗原包被板、血清樣品稀釋液、洗滌液、TMB底物液、終止液；抗原包被板包括預包被r2E2抗原、抗原穩定劑、酶標板、封閉液、標準IgG樣品；

所述抗原組成為：N-domainA-Cys-Lys5-linker-Lys5-Cys-domain A-C。

2.根據權利要求1所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：酶標板所包被抗原的包被濃度為1ng～10ng/mL。

3.根據權利要求1或2所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：抗原穩定劑組成為，體積濃度為0.01％多聚甲醛PBS緩沖液，50μl/孔，室溫，作用5min。

4.根據權利要求3所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：封閉液組分為質量濃度為0.5-10％蔗糖、質量濃度1.0-8.0％明膠、質量濃度0.1-6.0％的酪蛋白，1×PBST，pH 7.2，200μl/孔。

5.根據權利要求4所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：HRP-IgG酶標記抗體在ELISA中的工作濃度為1∶10,000～1∶100,000，HRP-IgG質量含量為0.425ng/mL～4.25ng/mL。

6.根據權利要求5所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：標準IgG樣品為0μg/ml，15μg/ml，50μg/ml，250μg/ml樣品和待檢測血清樣本，均以50μl/孔加入到對應孔中，同時加入100μl/孔酶標記抗體HRP-IgG，37℃孵育60min。

7.根據權利要求6所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：TMB底物液反應體積為100μl/孔，避光室溫作用25-30min顯色，TMB底物液為底物A和底物B按照1:1混合使用，底物A為5mg/mL DMSO溶液；底物B為500ml雙蒸水溶解13.608gCH₃COONa·3H₂O，用1mol/L檸檬酸調pH至6.0，加入1mL 30％雙氧水，定容至1000ml。

8.根據權利要求7所述的一種定量檢測豬瘟病毒IgG抗體競爭ELISA試劑盒，其特征在于：所述的終止液為1.5mol/L H₂SO₄，50μl/孔。