[發(fā)明專利]檢測Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710299012.2
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107012234B
• 公開（公告）日: 2020-05-22
• 發(fā)明（設計）人: 梅世月;孔祥東;白楠;孟靜靜
• 申請（專利權(quán)）人: 鄭州大學第一附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 北京思創(chuàng)大成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11614
• 代理人: 張清芳

本發(fā)明涉及基因缺失檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測Y染色體微缺失的多重PCR引物組、試劑盒和應用。所述多重PCR引物組包括通用引物和特異性引物，所述通用引物具有如SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的堿基序列：其中，SEQ ID NO：1所示堿基序列的5’端標記有熒光基團；所述特異性引物包括具有如SEQ ID NO：3～SEQ ID NO：22所示堿基序列的引物。本發(fā)明克服了傳統(tǒng)多重PCR靈敏度低、非特異性擴增等缺點，通過一套新型的穩(wěn)定的通用引物?多重PCR的反應體系結(jié)合熒光標記通用引物的方法，擴增產(chǎn)物經(jīng)毛細管電泳分析，確保了檢測的高靈敏度，有效降低了成本，并且可以實現(xiàn)大樣本量的高效檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因缺失檢測領(lǐng)域，更具體地，涉及一種檢測Y染色體微缺失的多重PCR引物組、包括多重PCR引物組的該試劑盒和所述多重PCR引物組及試劑盒作為檢測Y染色體微缺失試劑的應用。

背景技術(shù)

根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)的研究報告，全世界約有15％的育齡夫婦被不孕(育)癥所困擾，其中男性因素約占50％。30％以上男性生不育是由于遺傳學因素導致，主要為克氏綜合征和Y染色體微缺失。細胞遺傳學和分子生物學研究證實位于Y染色體長臂上的無精子因子(azoospermia factor，AZF)區(qū)域的微缺失可以造成生精障礙，導致無精癥或嚴重少精子癥。Vogt等人將AZF區(qū)分為AZFa、AZFb和AZFc三個亞區(qū)，1998年Vogt等人發(fā)現(xiàn)AZFb區(qū)和AZFc區(qū)之間還存在AZFd區(qū)。任何一個亞區(qū)的微缺失都可能導致生精障礙，而睪丸的病理改變與AZF區(qū)微缺失的部位存在明顯的相關(guān)性。目前檢測Y染色體AZF區(qū)微缺失已經(jīng)成為男性無精癥或少精癥患者的常規(guī)檢查。AZF區(qū)微缺失是否存在，為遺傳咨詢提供依據(jù)，也為臨床診斷與后續(xù)治療提供指導。輔助生殖技術(shù)的快速發(fā)展，尤其是卵細胞胞漿內(nèi)精子注射(intracytoplasmic sperm injection，ICSI)技術(shù)給男性不育患者帶來了希望，然而某些類型的Y染色體微缺失患者無法通過自身睪丸取精進行ICSI。另外，ICSI技術(shù)的局限性是：有可能將攜帶有染色體異常或者基因突變等遺傳缺陷的精子注入到卵細胞內(nèi)，卵子受精發(fā)育，所攜帶的遺傳缺陷傳遞給下一代。因此，臨床上建議精子濃度＜5×10⁶/mL的男性都要進行Y染色體微缺失的檢測。這不僅可以為無精癥或少精癥患者的遺傳咨詢提供依據(jù)，也為臨床診斷與后續(xù)治療提供指導，避免不必要的藥物和手術(shù)治療以及遺傳缺陷的傳遞。

因此，建立一種簡單快速、準確度高且低成本的分子遺傳學檢測方法對臨床具有重要意義。

目前Y染色體AZF區(qū)微缺失的檢測主要是針對Y染色體特定序列標簽位點(STS)。根據(jù)歐洲男科協(xié)會(EAA)和歐洲分子遺傳質(zhì)控網(wǎng)(EMQN)聯(lián)合發(fā)布的《Y染色體微缺失的最佳實踐操作指南》(2013年)，推薦采用多重PCR檢測AZF區(qū)的6個STS(AZFa：sY84，sY86；AZFb：sY127，sY134；AZFc：sY254，sY255)。在此基礎(chǔ)上，各個檢測實驗室可選擇性地增加STS的數(shù)量進行更精確的檢測。目前檢測AZF區(qū)微缺失的方法包括多重PCR-凝膠電泳法、多重熒光PCR法、芯片雜交法、多重連接探針擴增(MLPA)等多種方法。最常用的是針對序列標簽位點(STS)，采用多重PCR擴增-凝膠電泳檢測，根據(jù)條帶的有無對AZF各區(qū)的缺失情況做出定性分析。目前該方法已成為檢測AZF微缺失的行業(yè)“金標準”；但是該方法的檢測敏感性不高，凝膠電泳易造成PCR產(chǎn)物污染導致假陽性；每個樣本需要3-4組PCR反應，操作繁瑣，其檢測通量小，不適用于對大樣本量的檢測。多重熒光PCR方法具有簡便、快速、準確的特點，但是探針設計繁瑣并且需要報告基團修飾，價格昂貴，不適合臨床推廣使用。目前，根據(jù)上述這兩種檢測方法，已有多種的Y染色體微缺失檢測試劑盒面世。芯片雜交技術(shù)也有報道用于檢測AZF區(qū)微缺失，該方法具有極高的準確度和靈敏度；但是該方法需要設計大量的探針，成本較高，并且其檢測、分析也較為復雜，不適合臨床醫(yī)生判讀。MRC-Holland公司的MLPA試劑盒(P360Y-Chromosome)通過探針雜交、連接手段分析Y染色體特定區(qū)域相對拷貝數(shù)，該方法覆蓋的范圍廣、能準確定量分析，但是其結(jié)果分析復雜，解讀還不完善，目前還只適用于基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。