[發明專利]一種酶法水解定向制備褐藻膠寡糖的方法

有效

• 申請號: 201710298634.3
• 申請日: 2017-05-02
• 公開（公告）號: CN106884025B
• 公開（公告）日: 2020-05-12
• 發明（設計）人: 牟海津;楊敏;李麗
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12P19/00
• 分類號: C12P19/00;C12N9/88;C12N15/60
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明提供一種酶法水解定向制備褐藻膠寡糖的方法，其中使用的褐藻膠裂解酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3。本發明利用基因改造的重組褐藻膠裂解酶，定向制備褐藻膠寡糖，與現有酸法水解制備褐藻膠寡糖的方法相比，克服了破壞性大、效率低的缺點，與現有的酶法水解制備褐藻膠寡糖的方法相比，運用改造的重組褐藻膠裂解酶，克服了酶解時間長、成本高、不能定向制備特定聚合度的褐藻膠寡糖的缺點。本發明過程簡單、成本低且適用于工業化生產，能夠在短時間內降低褐藻膠粘度，所制寡糖的總得率在90％以上。所制備的褐藻膠寡糖有抗腫瘤、抗炎、降血脂和提高免疫力等功效，可用于食品及保健品領域，具有廣泛的應用前景。

技術領域

本發明屬于褐藻膠寡糖制備技術領域，具體涉及一種酶法水解定向制備褐藻膠寡糖的方法。

背景技術

褐藻膠寡糖(alginate oligosaccharides)是褐藻膠經水解而得到的聚合度小且水溶性好的低分子量片段。由于褐藻膠寡糖具有降血脂、抗病毒、抗腫瘤以及抗氧化等多種生理活性，可廣泛應用在食品、醫藥及化妝品等領域，具有巨大的應用和開發價值。最新研究表明：用褐藻膠制備的聚M段寡糖藥物“971”能抑制β淀粉樣細胞的聚集和細胞毒性，正用于抗阿爾茲海默癥的二期臨床研究；聚G寡糖可與抗生素協同抑制臨床多耐藥致病菌。因此，組成特殊、聚合度特定的褐藻膠寡糖具有重要應用價值和經濟價值，實現這類寡糖的高效制備具有重要意義。

褐藻膠寡糖的制備方法主要有酸法水解和酶法水解。酸法水解會不同程度破壞褐藻膠寡糖的結構，而酶法水解具有反應條件溫和等優點，因此，酶法水解制備褐藻膠寡糖受到廣泛關注。海洋微生物是褐藻膠裂解酶的重要來源，一些褐藻膠裂解酶相繼從弧菌、交替單胞菌、假交替單胞菌中分離出來。但由于海洋環境的特殊性，導致海洋微生物產生的褐藻膠裂解酶活性有限、不能定向制備褐藻膠寡糖。因此，尋找專一性強、活力高的褐藻膠裂解酶仍是研究者關注的重點。

發明內容

本發明的目的是提供一種酶法水解定向制備褐藻膠寡糖的方法，通過改造后的酶能夠高效、定向地制備目標褐藻膠寡糖，解決現有技術存在的效率低、不能定向制備褐藻膠寡糖的缺點。

本發明首先提供一種酶法水解定向制備褐藻膠寡糖的方法，包括如下的步驟：

1)底物配制：將褐藻膠原料與水混合，配制成濃度為5％-8％的pH值為中性的酶解底物溶液；

2)分步酶解：加入褐藻膠裂解酶，于40-50℃下攪拌酶解1-2h，再次加入0.3％-0.8％的褐藻膠裂解酶，攪拌酶解，總酶解時間為2-4h；

3)低聚糖制備：酶解結束后，過濾或離心除去渣子，上清液濃縮、冷凍干燥得到海藻低聚糖。

上述的方法中，其中褐藻膠裂解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:1；

為了獲得聚合度更為集中的褐藻膠寡糖，本發明對褐藻膠裂解酶進行了優化，優化后的褐藻膠裂解酶的氨基酸序列為SEQ ID NO:3；

本發明所提供的優化的，能定向制備褐藻膠寡糖的褐藻膠裂解酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO:3：

MKVSCAVVLSACIASANADNNGDGKADSIKENDLNAGYADGTYFYTAADGGMVFRCPIDGYKTSTNTSYTRTELREMLRRGDTSIATQGVNGNNWVFGSAPASAREAAGGVDGVLRATLAVNHVTTTGDSGQVGRVIVGQIHANNDEPLRLYYRKLPGHSKGSVYIAHEPNGGSDSWYDMIGSRSSSASDPSDGIALDEVWSYEVKVVGNTLTVTIFRAGKDDVVQVVDMGNSGYDVADQYQYFKAGVYNQNNTGNASDYVQVTFYALEQSHD；

編碼上述褐藻膠裂解酶的基因，其一種核苷酸序列為SEQ ID NO:4: