[發明專利]基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法

有效

• 申請號: 201710298324.1
• 申請日: 2017-05-01
• 公開（公告）號: CN107238598B
• 公開（公告）日: 2019-09-17
• 發明（設計）人: 陳偉;鄧豪華;林秀玲;彭花萍;李柯林
• 申請（專利權）人: 福建醫科大學
• 主分類號: G01N21/76
• 分類號: G01N21/76;G01N21/33
• 代理公司: 福州智理專利代理有限公司 35208
• 代理人: 王義星

本發明公開一種基于殼聚糖?鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是利用酸性磷酸酶水解抗壞血酸磷酸酯生成抗壞血酸，影響殼聚糖?鉑模擬氧化酶/3，3’，5，5’?四甲基聯苯胺鹽酸鹽催化顯色反應體系，結合溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，直接用于酸性磷酸酶及其抑制劑含量的測定。在0.25~2.5 U/L范圍內，吸光度變化值△A₄₅₀與酸性磷酸酶濃度呈線性關系，檢測限為0.0161 U/L。本發明操作簡便、靈敏度高，能夠作為分析方法應用于環境及生命科學體系中酸性磷酸酶及其抑制劑含量的測定。

技術領域

本發明涉及殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化顯色體系的酸性磷酸酶及其抑制劑的測定方法，屬于分析化學和納米技術領域。

背景技術

酸性磷酸酶是一種在酸性條件下催化磷酸單酯水解生成無機磷酸的一種水解酶，廣泛分布在一些植物或是哺乳動物的組織中。農業方面，酸性磷酸酶對判斷農作物生長的最適pH有重要作用。醫學方面，其可作為肝炎、甲狀旁腺功能亢進、紅血球病變等疾病的重要診斷指標。因此，酸性磷酸酶含量的測定有著深遠意義。但目前酸性磷酸酶的測定還存在諸多局限，例如，現有方法主要選用4-硝基苯磷酸二鈉作為底物，然而水解反應產生的硝基苯需要在堿性條件下才有比較強的信號，這與酸性磷酸酶的最適催化條件（pH = 5.0）相矛盾。故發展一種更有效、準確的比色方法來測定酸性磷酸酶具有非常重要的實際意義。

酸性磷酸酶在溫度為37℃，pH為5.0的條件下可以水解抗壞血酸磷酸酯，生成抗壞血酸。而具有強還原型的抗壞血酸可以抑制氧化酶對3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽的催化氧化作用，使得3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色不明顯。酸性磷酸酶的含量越高，體系的吸收度值越小。基于此，可實現對酸性磷酸酶進行定量測定。

本發明以抗壞血酸磷酸酯為酸性磷酸酶底物，以殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系為檢測信號源，建立了一種比色測定酸性磷酸酶的方法。酸性磷酸酶催化水解反應和殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色反應可在同一pH下進行。該方法簡便、快捷，不涉及任何復雜、貴重的儀器，檢測成本低。

發明內容

本發明的目的是提供一種利用殼聚糖-鉑模擬氧化酶催化氧化3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽顯色體系，以抗壞血酸磷酸酯為底物，從而測定酸性磷酸酶及其抑制劑的方法。

為了實現上述目的，本發明采用以下技術方案：

本發明所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是在抗壞血酸磷酸酯和酸性磷酸酶反應產物中加入3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，反應后加入硫酸溶液終止反應，根據溶液顏色和紫外吸收光譜特征的變化，用于酸性磷酸酶含量的測定；所使用的殼聚糖-鉑模擬氧化酶是用殼聚糖作為穩定劑，硼氫化鈉還原氯鉑酸得到，具體合成步驟如下：稱取0.1 g殼聚糖溶解于50 mL濃度為1%v/v的醋酸中，攪拌15分鐘使殼聚糖完全溶解即得到濃度為0.002 g/mL的殼聚糖溶液，將2mL濃度為10 mmol/L氯鉑酸加入到47 mL濃度為0.002 g/mL殼聚糖溶液中，攪拌30分鐘，然后逐滴加入1 mL濃度為0.2 mol/L新配制的硼氫化鈉溶液并在5分鐘之內加完，置于暗處攪拌90分鐘，得到殼聚糖-鉑模擬氧化酶，所得產物避光冷藏保存。

所述的基于殼聚糖-鉑模擬氧化酶的酸性磷酸酶測定方法，其特征是將50 μL濃度為4 mmol/L的抗壞血酸磷酸酯和50 μL不同濃度的酸性磷酸酶加入到200 μL pH為 5，濃度為50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液中，混合均勻后在37℃下反應30分鐘，然后依次加入632.5 μLpH為 5，濃度為50 mmol/L的醋酸鹽緩沖液、50 μL濃度為3 mmol/L的3，3’，5，5’-四甲基聯苯胺鹽酸鹽溶液和17.5 μL殼聚糖-鉑模擬氧化酶溶液，混合均勻后再在37℃下反應5分鐘，加入200 μL濃度為2 mol/L的硫酸溶液終止反應，測定溶液的吸光度值A₄₅₀。