[發明專利]一種快速獲取轉基因玉米草甘膦耐受性表型的方法

有效

• 申請號: 201710295884.1
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107084943B
• 公開（公告）日: 2019-06-25
• 發明（設計）人: 何勇;劉小丹;馮旭萍;劉飛
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/359
• 分類號: G01N21/359;G01N21/33;G01N21/55;G06F17/50
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司 33224
• 代理人: 胡紅娟

1.一種快速獲取轉基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，包括：

S1：種植同等數量的轉基因玉米和非轉基因玉米，在玉米生長過程中，對一部分數量的轉基因玉米和非轉基因玉米噴施濃度為1080g a.e.ha^-1的草甘膦溶液作為實驗組，對剩余的轉基因玉米和非轉基因玉米噴施等量的水作為對照組；

S2：通過制定莽草酸標準曲線結合紫外分光光度法，獲得受草甘膦脅迫不同天數的轉基因玉米和非轉基因玉米的植株冠層葉片的莽草酸含量；

S3：利用高光譜成像系統，獲取受草甘膦脅迫不同天數的轉基因玉米和非轉基因玉米的植株冠層的高光譜數據，得到樣本在可見近紅外波段的吸光度；

S4：采用小波變換對高光譜數據預處理，去除噪聲并剔除異常樣本；

S5：對經過預處理的高光譜數據進行特征波長選擇；

S6：通過SPXY方法將實驗組和對照組內的樣本分為建模集和預測集；

S7：以建模集內樣本的特征波長的反射率值作為輸入變量，步驟S2中測量得到的莽草酸含量作為輸出變量，建立LSSVM回歸分析模型；

Y＝56967.52*λ₁+41852.64*λ₂-55015.29*λ₃+2881.984*λ₄+9109.073*λ₅-95879.78*λ₆+42727.5*λ₇-18709.43*λ₈+99941.35*λ₉-132229.1*λ₁₀+52584.88*λ₁₁+107.4436*λ₁₁+38980.16*λ₁₃-1926.05*λ₁₄+22470.85*λ₁₅-773.9245*λ₁₆+194.71162

其中，Y為莽草酸含量，λ₁～λ₁₆分別為高光譜數據中對應的玉米樣本的反射率計算所得的吸光度；

S8：將預測集內樣本的特征波長對應的吸光度輸入所述的LSSVM回歸分析模型，得出預測集內各樣本的莽草酸含量。

2.如權利要求1所述的快速獲取轉基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步驟S1中，分別種植120盆轉基因玉米和非轉基因玉米，其中轉基因玉米內轉入cry1Ab/cry2Aj-G10evo基因，在玉米生長至3葉期時，將草甘膦溶液置于便攜式CO₂高壓噴霧器中，分別對80株轉基因玉米和非轉基因玉米植株進行噴施作為實驗組，噴施壓力為23lb pol^-2，噴施量為120L ha^-1，在同等條件下，分別對40株轉基因玉米和非轉基因玉米植株噴施等量的水作為對照組；

在噴施后的第2、4、6、8天各取轉基因玉米和非轉基因玉米各20株，噴施水的轉基因玉米和非轉基因玉米各10株進行實驗，共有實驗樣本240個。

3.如權利要求1所述的快速獲取轉基因玉米草甘膦耐受性表型的方法，其特征在于，在步驟S2中，獲取樣本內莽草酸含量的具體過程如下：

S2.1：獲取莽草酸提取物：每個樣本取0.1g葉片加入1.5ml的0.25mol/L的HCl提取液中，在冰浴狀態下迅速碾磨，于12000r/min離心10min，收集離心上清液；

S2.2：測定莽草酸提取物的OD值：取200μl的離心上清液加入微量滴定板上，加入2ml濃度為1％的高碘酸，3h后，加入2ml的1mol/L的NaOH溶液，再加入1.2ml的0.1mol/L的甘氨酸，混勻后放置5min，在紫外分光光度計380nm下比色，記錄OD值；

S2.3：測定莽草酸標準品的OD值并繪制莽草酸標準品的濃度與OD值的標準曲線：將sigma莽草酸標準品10mg溶于1.5ml、0.25mol/LHCL中，取0、1、2.5、5、10μl加入0.25mol/LHCL至1.0ml，用測定莽草酸標準品OD值，并繪制莽草酸標準品的濃度與OD值的標準曲線，計算得到每個樣本的莽草酸含量。