[發明專利]肉蛋白多肽標志物用于牛肉的摻偽鑒別方法

在審

• 申請號: 201710293634.4
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107085054A
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 祝偉霞;楊冀州;劉亞風;徐超;楊娜;趙芳;楊志聰
• 申請（專利權）人: 河南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 鄭州天陽專利事務所(普通合伙)41113
• 代理人: 聶孟民

1.一種肉蛋白多肽標志物用于牛肉的摻偽鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、制備動物生肉、熟肉、肉制品：

所述的動物為牛、馬、豬、兔、雞、鴨；

(2)動物肉的預處理：

生肉和熟肉不做預處理，肉制品用乙醇、乙醚進行洗滌預處理；

(3)、摻假牛肉的制備：

A、非標混合肉的制作：所述的非標準肉是豬肉、馬肉、兔肉、雞肉或鴨肉，將非標準肉搗碎混合均勻，得非標混合肉；

B、制作不同摻假非標混合肉的牛肉：將標準牛肉(純牛肉)與非標混合肉按不同質量百分比混合均勻，制成不同比例的摻假牛肉；

(4)、BCA法測定蛋白含量：方法是，分別稱取生肉、熟肉、預處理后的肉制品作為樣品，分別加入蛋白提取液，混懸后冰浴，離心，孵育，取出冷卻至室溫，測定吸光度值；

(5)、肉蛋白的酶切：分別稱取生肉、熟肉、預處理后的肉制品作樣品，分別加入蛋白提取液，勻漿，冰上孵育，重復3次；在冰上靜置后加入預冷的丙酮，震蕩搖勻，靜置，再離心，棄上清液，用丙酮重懸后再次離心，棄掉上清，剩余固體用丙酮洗滌，將固體殘渣揮去溶劑；然后用尿素/碳酸氫銨溶液重新溶解固體，加入DTT儲備液反應，然后加入IAA儲備液避光反應；加入碳酸氫銨溶液，計算肉蛋白濃度，加入Trypsin，酶切過夜，取出，加入甲酸終止反應，得動物肉多肽溶液；

(6)、凈化除鹽：HLB柱依次用甲醇、水活化，將動物肉多肽溶液離心，分別取上清液上載至HLB柱中，待樣液全部流出后用水淋洗，使柱體保持抽干，再用甲醇洗脫，將收集的洗脫液于氮氣流下濃縮至干，加入乙腈-甲酸溶解殘渣，渦旋混勻，超聲，過濾凈化除鹽；

(7)、上液相色譜-四級桿串聯質譜測定動物肉中特征多肽：方法是，凈化除鹽后的動物肉多肽溶液上液相色譜-四級桿串聯質譜測定，在高分辨質譜掃描、Maxquant、Sieve數據分析的基礎上得到的特征多肽信息，LC-MS/MS方法首先在子離子掃描模式下，以HPLC-Q/Exactive中篩選出帶2個或3個的電荷離子為母離子進行全掃描，獲得特征子離子，以特征子離子對作為肉蛋白多肽標志物進行定性與定量分析，從而實現牛肉摻偽鑒別。

2.根據權利要求1所述的肉蛋白多肽標志物用于牛肉的摻偽鑒別方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)、肉類的制備：

所述的肉類為牛肉、馬肉、豬肉、兔肉、雞肉、鴨肉，其中：

生鮮肉：將市場購得的生鮮肉切成小塊置于-80℃冰箱中冷凍；

熟肉：將生鮮肉在190℃加熱1h，成熟肉，真空至干；

肉制品：煎炸肉：將生鮮肉放入高溫植物油油中煎炸5min，取出后冷卻至室溫；腌肉：將生鮮肉加入氯化鈉腌制24h，取出后用清水清洗，真空至干；肉腸：將生鮮肉中按常規方法加入辣椒面、花椒粉、白酒，裝腸；肉泥：將生鮮肉加入20％氯化鈉，4℃腌制4天，加水放置加熱板上加熱攪拌20min，再于高壓蒸鍋121℃蒸制15min；

(2)動物肉的預處理：

生肉和熟肉不做預處理，肉制品每2g用體積濃度95％乙醇洗2次，每次20mL，再用乙醚洗2次，每次10mL，然后將溶劑蒸發干，置于-80℃冰箱中；

(3)制備摻假牛肉：

非標混合肉的制作：取非標準肉各100g于組織搗碎機中混合均勻，制得非標混合肉，裝入密封樣品袋中保存；

所述的非標準肉為豬肉、馬肉、兔肉、雞肉、鴨肉；

制作不同摻假非標混合肉的牛肉：將標準牛肉(純牛肉)與非標混合肉混合均勻，制成摻假質量比例分別為0.1％、0.2％、0.5％、1.0％、2.0％、5.0％、10％、20％、40％、60％、80％、90％、95％、100％的摻假牛肉；

(4)、BCA法測定蛋白含量：方法是，分別稱取生肉、熟肉、預處理后的肉制品100g作為樣品，分別加入1000μL蛋白提取液，混懸后冰浴10min，4℃下13000r/min轉速下離心10min，37℃孵育30min，取出冷卻至室溫，于562nm波長下，用酶標儀測定吸光度值；

所述的蛋白提取液是：取50mL 1M TrisHCl，37.5mL 4M NaCl，4mL 0.5M EDTA，10mL NP-40，10mL 10％SDS，用水定容至1000mL；

測定蛋白濃度的計算公式為：

取10次樣品測定的平均數，見下表1：

表1 肉平均蛋白濃度(n＝10)

(5)、肉蛋白的酶切：分別稱取生肉、熟肉、預處理后的肉制品300mg作樣品，分別加入1000μL蛋白提取液，以勻漿機上最大速度勻漿20s，在冰上孵育40s，重復3次；在冰上靜置10min，然后加入樣品3倍體積的-20℃冰箱預冷過夜的丙酮，震蕩搖勻，-20℃靜置2h，再在15000r/min離心10min，棄掉上清液，用丙酮重懸后再次離心，棄掉上清，剩余固體用丙酮洗3次，將固體殘渣通風自然揮發掉多余的溶劑；然后用200μL的8M尿素/50mM碳酸氫銨溶液重新溶解固體，加入1M的DTT儲備液使濃度保持在10mM，在56℃下反應40min，然后加入0.5M的IAA儲備液使濃度保持在50mM，常溫下避光反應40min；加入200μL碳酸氫銨溶液，根據步驟(4)計算公式1得到的肉蛋白濃度，按Trypsin濃度：蛋白濃度＝1:20的比例加入Trypsin，37℃恒溫培養箱中酶切過夜，取出，加入2μL甲酸終止反應，得動物肉多肽溶液；

所述的1M的DTT儲備液是：稱取0.154g二硫代蘇糖醇，加入1mL水溶解，配制成1mol/L二硫代蘇糖醇水溶液；

所述的0.5mol/L的IAA儲備液是：稱取0.185g碘乙酰胺，加入0.5mL水溶解，配制成0.5mol/L的碘乙酰胺母液；

所述的50mM碳酸氫銨溶液是：稱取碳酸氫銨0.395g加入100mL水混勻制成；

所述的8M尿素溶液是：稱取48.05g尿素，0.395g碳酸氫銨，加水溶解，定容至100mL制成；

所述的Trypsin濃度為1μg/μL，制備方法是，將100μL 1mmol/L鹽酸加入到含有100μg胰蛋白酶凍干粉的離心管中，混勻；

(6)、凈化除鹽：HLB柱依次用3mL甲醇、3mL水活化，將動物肉多肽溶液離心，分別取上清液上載至HLB柱中，待樣液全部流出后用3mL水淋洗，使柱體保持抽干5min，再用5mL甲醇洗脫，將收集的洗脫液于氮氣流下濃縮至干，氮吹儀水浴溫度保持40℃，加入體積比1:9的1mL乙腈-0.1％甲酸溶解殘渣，渦旋混勻3min，超聲5min，經0.2μm濾膜過濾凈化除鹽；

所述體積比1:9的乙腈-0.1％甲酸的甲酸水溶液是：量取1mL甲酸加入1000mL水中配制成0.1％的甲酸水溶液，取10mL乙腈與90mL0.1％的甲酸水溶液混勻，于0℃-4℃保存；

(7)、上液相色譜-四級桿串聯質譜測定動物肉中特征多肽：方法是，凈化除鹽后的動物肉多肽溶液上液相色譜-四級桿串聯質譜測定；

液相條件：

液相色譜柱：CAPCELL PAK MG2(150mm×2.1mm,5μm)；柱溫：35℃；流動相：0.1％甲酸乙腈A與0.1％甲酸水溶液B；梯度洗脫程序：0min，20％A相和80％B相；7min，40％A相和60％B相；8min，90％A相和10％B相；10min，90％A相和10％B相；10.1min，20％A相和80％B相；14min，20％A相和80％B相；流速：0.3mL/min；進樣量：10μL；

質譜條件：

電噴霧離子化方式下正電離(ESI+)；霧化氣：413.7kPa(60psi)；氣簾氣；172.4kPa(25psi)；噴霧電壓：5000V；去溶劑溫度：550℃；去溶劑氣：344.8kPa(50psi)；碰撞氣：69kPa(10psi)，每個離子對駐留時間：10ms，去簇電壓(DP)：80V，每種化合物的檢測離子對、碰撞室出口電壓(CXP)、射入電壓(EP)、碰撞能量(CE)的質譜參數見表2；

表2 質譜參數

在高分辨質譜掃描、Maxquant、Sieve數據分析的基礎上得到的特征多肽信息見表3：

表3 特征多肽的保留時間和精確分子量

LC-MS/MS方法首先在子離子掃描模式下，以HPLC-Q/Exactive中篩選出帶2個或3個的電荷離子為母離子進行全掃描，獲得特征子離子，以特征子離子對作為肉蛋白多肽標志物進行定性與定量分析，從而實現牛肉摻偽鑒別。