[發明專利]檢測人外周血EVs?TRPC5含量的試劑盒及方法

在審

• 申請號: 201710293234.3
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN106996971A
• 公開（公告）日: 2017-08-01
• 發明（設計）人: 馬鑫;陸揚帆;黃飚;金堅;杜夢繁;張藝;張玨
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N33/543
• 代理公司: 深圳市韋恩肯知識產權代理有限公司44375
• 代理人: 李玉平

1.一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析試劑盒，其特征在于：包括MUC1包被的NHS磁珠、多孔包被板、緩沖液、TRPC5多肽標準品、TRPC5的抗體、銪標記的羊抗兔抗體、洗滌液及增強液。

2.一種利用權利要求1所述的試劑盒檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于包括以下步驟：

(1)合成TRPC5多肽；

(2)用步驟(1)合成的所述TRPC5多肽作為包被原包被固相載體；

(3)用步驟(1)合成的所述TRPC5多肽通過偶聯劑與KLH偶聯得到免疫原；

(4)用步驟(3)得到的所述免疫原制備抗TRPC5的多克隆抗體；

(5)用促凝血清管采集新鮮血液，1000-2000r/min離心5-20min后收集上清液，用MUC1抗體包被的免疫磁珠與所述上清液混合后，經25-37℃震蕩孵育0.5-2h或經2-8℃反應過夜，磁力架吸附磁珠，用緩沖液沖洗并重懸，得到待測樣品；

(6)將步驟(5)所述待測樣品進行競爭抑制檢測分析，測量熒光強度，對照標準曲線計算樣品中的TRPC5含量。

3.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(3)所述偶聯劑為Sulfo-SMCC。

4.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(3)所述的免疫原免疫新西蘭白兔，通過皮下多點注射制備抗體，使用抗原親和柱進行純化，獲得步驟(4)所述的抗TRPC5的多克隆抗體。

5.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(2)所述固相載體為96孔微孔板。

6.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(5)所述緩沖液為磷酸鹽緩沖液。

7.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(5)所述免疫磁珠為NHS磁珠。

8.根據權利要求7所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：所述NHS磁珠購自蘇州Beaver公司。

9.根據權利要求2所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于：步驟(6)所述標準曲線為步驟(1)合成的所述TRPC5多肽作為標準品，稀釋成為0ng/mL，5ng/mL，10ng/mL，20ng/mL，40ng/mL，50ng/mL，80ng/mL，100ng/mL，200ng/mL，400ng/mL，500ng/mL，800ng/mL，1000ng/mL系列濃度，稀釋液為0.1mol/L pH7.5磷酸鹽緩沖液，進行競爭抑制檢測分析，將檢測結果熒光值與標準品濃度取對數即log10，線性擬合，作為標準曲線。

10.根據權利要求2～9所述的一種檢測TRPC5含量的時間分辨熒光免疫分析方法，其特征在于，所述MUC1抗體包被的免疫磁珠制備方法為：

a.蛋白溶液配制：取50-100μg MUC1蛋白通過透析或者脫鹽的方法徹底除去原有buffer里含伯胺基的物質，然后再用Coupling Buffer配成濃度為3.0-5.0mg/mL的蛋白溶液，將配制好的蛋白溶液于2-8℃保存備用；

b.取200-500μL 20％的磁珠懸浮液于EP管中；

c.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，去除上清液；

d.加1mL 2-8℃的Washing Buffer A于離心管中，渦旋15-30s，使磁珠混合均勻；

e.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，去除上清液；

f.加200-500μL蛋白溶液于EP管中，渦旋15-30s，使其混合均勻；

g.將EP管渦旋15-30s，置于垂直混合儀上，2-8℃反應過夜；

h.采用磁性分離架富集磁珠，保存流穿液；

i.加0.5-1mL Blocking Buffer于EP管中，渦旋15-30s，將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液；

j.加0.5-1mL Blocking Buffer于EP管中，渦旋15-30s，將EP管置于垂直混合儀中室溫反應2-4h；

k.將EP管置于磁性分離架內，富集磁珠，棄上清液；

l.加0.5-1mL超純水于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液；

m.加0.5-1mL Storage Buffer于EP管中，充分混合，用磁力架富集磁珠，棄上清液；重復該操作2次；

n.加入0.5-1mL Storage Buffer于EP管中，充分混合，2-8℃保存備用。