[發明專利]一種工程菌及其用于制備睪丸酮的用途

有效

• 申請號: 201710291852.4
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN108796021B
• 公開（公告）日: 2021-03-19
• 發明（設計）人: 常尊學;張鑫;隋靚;鄒雷
• 申請（專利權）人: 沈陽博泰生物制藥有限公司;沈陽藥科大學
• 主分類號: C12P33/00
• 分類號: C12P33/00;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12R1/19;C12R1/01;C12R1/38
• 代理公司: 北京泛華偉業知識產權代理有限公司 11280
• 代理人: 李渤;郭廣迅

1.一種具有睪丸酮乙酸酯水解酶活性的微生物在制備睪丸酮中的用途，其中，所述微生物使用睪丸酮乙酸酯為底物；并且所述睪丸酮乙酸酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的用途，其中，所述微生物選自大腸桿菌、酵母菌、分枝桿菌、紅球菌、假單胞菌和放線菌。

3.根據權利要求1或2所述的用途，其中，所述睪丸酮乙酸酯水解酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一種用于生產睪丸酮的工程菌，所述工程菌具有編碼睪丸酮乙酸酯水解酶的基因；其中，所述睪丸酮乙酸酯水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

5.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的宿主細胞選自大腸桿菌、酵母菌、分枝桿菌、紅球菌、假單胞菌和放線菌。

6.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌E.coli BL21(DE3)。

7.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌的質粒載體選自pET26b(+)或pET28a(+)。

8.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述睪丸酮乙酸酯水解酶的編碼核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

9.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌為將編碼睪丸酮乙酸酯水解酶的基因通過原核表達載體轉入大腸桿菌中或將編碼睪丸酮乙酸酯水解酶的基因插入到宿主菌的染色體上，篩選獲得的可表達睪丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

10.如權利要求4所述的工程菌，其中，所述工程菌為通過將編碼睪丸酮乙酸酯水解酶基因經過Nde I和Hind III雙酶切處理后，插入到pET26b(+)的Nde I和Hind III酶切位點之間得到的重組表達載體轉入大腸桿菌中，篩選獲得的可表達睪丸酮乙酸酯水解酶的工程菌。

11.一種生產睪丸酮的方法，所述方法包括以下步驟：

1)將如權利要求1至3中任一項所述的用途中的微生物或如權利要求4至10中任一項所述的工程菌發酵至對數期，然后對其進行誘導表達；

2)以睪丸酮乙酸酯為底物，使用步驟1)得到的微生物或工程菌進行催化反應，得到睪丸酮。

12.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟1)中，當所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌時，誘導表達的誘導試劑為IPTG。

13.根據權利要求12所述的方法，其中，所述IPTG的終濃度為0.5-2mM。

14.根據權利要求13所述的方法，其中，所述IPTG的終濃度為1mM。

15.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟1)中，當所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌時，所述誘導表達的培養溫度為15-37℃。

16.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟1)中，當所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌時，所述誘導表達的培養溫度為22℃。

17.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟1)中，當所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌時，所述誘導表達的培養時間為12-36小時。

18.根據權利要求11所述的方法，其中，在步驟1)中，當所述工程菌的宿主細胞為大腸桿菌時，所述誘導表達的培養時間為24小時。