[發明專利]一種合成3-羥基丙酸的重組菌及其構建方法和應用

有效

• 申請號: 201710291755.5
• 申請日: 2017-04-28
• 公開（公告）號: CN107119002B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 趙廣;李申;馮新軍
• 申請（專利權）人: 中國科學院青島生物能源與過程研究所;燃點科技（天津）有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 梁超

1.一種合成3-羥基丙酸的重組菌，其特征在于，宿主菌為大腸桿菌，表達編碼ATP依賴的蛋白酶水解亞單位的基因clpP、編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因accABCD和編碼丙二酸單酰輔酶A還原酶的基因mcr；所述ATP依賴的蛋白酶水解亞單位ClcP在NCBI的Gene ID為7150967，乙酰輔酶A羧化酶亞基AccA在NCBI的Gene ID為944895，乙酰輔酶A羧化酶亞基AccB在NCBI的Gene ID為947758，乙酰輔酶A羧化酶亞基AccC在NCBI的Gene ID為947761，乙酰輔酶A羧化酶基因亞基AccD在NCBI的Gene ID為946796，丙二酸單酰輔酶A還原酶MCR在NCBI的Gene ID為5827083。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述的編碼ATP依賴的蛋白酶水解亞單位的基因clpP和編碼乙酰輔酶A羧化酶的基因accABCD來源于大腸桿菌，編碼丙二酸單酰輔酶A還原酶的基因mcr來源于橙色綠屈撓菌。

3.一種構建權利要求1所述重組菌的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)克隆ATP依賴的蛋白酶水解亞單位基因clpP，將所得基因與質粒pETDuet進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，獲得重組載體pETDuet-clpP；

2)克隆丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr，將所得基因與步驟1)所得載體pETDuet-clpP進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，獲得重組載體pETDuet-clpP-mcr；

3)克隆乙酰輔酶A羧化酶亞基基因accA，將所得基因與質粒pACYCDuet-1進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，獲得重組載體pACYCDuet-accA；

4)克隆乙酰輔酶A羧化酶亞基基因accD，將所得基因與步驟3)所得pACYCDuett-accA進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，獲得重組載體pACYCDuet-accAD；

5)克隆乙酰輔酶A羧化酶亞基基因accBC，將所得基因與步驟4)所得pACYCDuett-accAD進行酶切、連接，并轉入E.coliDH5α感受態細胞中，篩選陽性克隆，提取質粒，獲得重組載體pACYCDuet-accADBC；

6)將步驟2)與步驟5)所獲得的重組載體，轉化到宿主Escherichia coli BL21(DE3)感受態細胞中，獲得重組菌。

4.根據權利要求3所述的構建方法，其特征在于，所述ATP依賴的蛋白酶水解亞單位基因clpP和乙酰輔酶A羧化酶基因accABCD來源于大腸桿菌，丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr來源于橙色綠屈撓菌；所述ATP依賴的蛋白酶水解亞單位基因clcP在NCBI的Gene ID為7150967，乙酰輔酶A羧化酶亞基基因accA、accB、accC和accD在NCBI的Gene ID分別為944895、947758、947761和946796，丙二酸單酰輔酶A還原酶基因mcr在NCBI的Gene ID為5827083。

5.一種應用權利要求1-2任一所述的重組菌發酵生產3-羥基丙酸的方法，其特征在于，步驟如下：

1)活化重組菌，獲得種子液；

2)將步驟1)所得的種子液，與含有氨芐青霉素與氯霉素的發酵培養基，按照體積比種子液：發酵培養基＝(1～2):(100～130)的比例接種后，35℃～37℃、180～220rpm、pH＝7.0條件下培養至OD₆₀₀在0.6～0.8，獲得培養液；

3)向所得的培養液中加入誘導劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.01～0.1mM，然后轉入30～33℃、180～220rpm、pH＝7.0條件下繼續培養24～48小時。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)所述培養條件為：37℃，180rpm。