[發明專利]灰飛虱抗藥性雌激素相關受體基因LSERR、降低灰飛虱抗藥性的基因片段及其應用

有效

• 申請號: 201710290800.5
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107266559B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 徐鹿;顧中言;李海東;許小龍;徐德進;徐廣春;韓召軍
• 申請（專利權）人: 江蘇省農業科學院
• 主分類號: C07K14/72
• 分類號: C07K14/72;C12N15/12;C12N15/113;C12N15/10;A01K67/033
• 代理公司: 南京艾普利德知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32297
• 代理人: 周海斌

1.一種降低灰飛虱抗藥性的dsRNA的用途，其特征是，該用途為降低灰飛虱針對氟啶蟲胺腈的抗藥性，所述dsRNA的模板的序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根據權利要求1所述的用途，其特征是，所述dsRNA的合成方法，包括以下步驟：

第一步、從灰飛虱材料中提取灰飛虱總RNA；所述灰飛虱材料至少包括灰飛虱卵、灰飛虱若蟲、灰飛虱成蟲之一；

第二步、先以灰飛虱總RNA為模板，反轉錄合成cDNA第一鏈；再以PCR合成灰飛虱cDNA模板；

第三步、采用引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R、以及灰飛虱cDNA模板進行PCR擴增，獲得dsRNA模板并進行純化；其中，所述引物dsLSERR-F的序列為5′端加有T7啟動子序列的SEQID NO.5所示序列，所述引物dsLSERR-R的序列為5′端加有T7啟動子序列的SEQ ID NO.6所示序列，所述T7啟動子序列如SEQ ID NO.7所示；

第四步、采用純化后的dsRNA模板，體外合成dsRNA并保存備用；所得dsRNA即為目標dsRNA。

3.根據權利要求2所述的用途，其特征是，在合成方法中，第一步的具體過程為：

采用總RNA提取試劑盒從灰飛虱材料中提取灰飛虱總RNA；以瓊脂糖凝膠電泳純化灰飛虱總RNA；以核酸蛋白定量儀檢測灰飛虱總RNA的濃度以及吸光度值；將灰飛虱總RNA凍存；

第二步的具體過程為：

以灰飛虱總RNA為模板，采用反轉錄試劑盒合成cDNA第一鏈；然后，采用cDNA第一鏈，于PCR儀中合成灰飛虱cDNA模板，具體合成條件為：37℃15min，85℃5s，12℃保持；所得灰飛虱cDNA模板凍存；

第三步的具體過程為：

采用引物dsLSERR-F和引物dsLSERR-R、以及灰飛虱cDNA模板進行PCR擴增，并獲得dsRNA模板，擴增時的PCR反應條件為：94℃3min，94℃30s，68℃30s以及72℃1min 10個循環，94℃30s以及72℃1min 28個循環，72℃10min，12℃保持；電泳純化所得dsRNA模板，并以回收試劑盒進行純化后保存；

第四步的具體過程為：

采用純化后的dsRNA模板，以試劑盒體外合成dsRNA，并以2～5倍反應體系的無核酸酶水溶解所得dsRNA，然后凍存備用。

4.根據權利要求3所述的用途，其特征是，在合成方法中，

第一步中，凍存灰飛虱總RNA的溫度為-80℃以下；第二步中，凍存灰飛虱cDNA模板的溫度為-20℃±5℃；第三步中，純化后保存dsRNA模板的溫度為-20℃±5℃；第四步中，凍存dsRNA的溫度為-80℃以下。