[發明專利]索羅金小球藻合成淀粉缺陷型突變株及其應用

有效

• 申請號: 201710286674.6
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107118968B
• 公開（公告）日: 2021-04-13
• 發明（設計）人: 韓丹翔;吳明燦;孫文超;胡強
• 申請（專利權）人: 國投生物科技投資有限公司
• 主分類號: C12N1/12
• 分類號: C12N1/12;C12N15/01;C12P7/64;C12Q1/04;C12R1/89
• 代理公司: 北京智為時代知識產權代理事務所(普通合伙) 11498
• 代理人: 王加嶺;楊靜

本發明提供經突變篩選后得到的索羅金小球藻合成淀粉缺陷型突變株GT?1?SLM1、GT?1?SLM2和GT?1?SLM3；其保藏編號分別為CGMCC No.13861、CGMCC No.13862和CGMCC No.13863，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。由于突變株合成淀粉的相關通路部分或者少部分受阻，細胞內淀粉含量顯著降低，而合成油脂的速率明顯加快，且細胞內最高油脂含量顯著提升。本發明突變株可縮短微藻產油周期，故可降低培養期間感染病害的風險，同時由于生物質中具有較高含量的油脂，因此可簡化后期油脂提取和制備工藝，為微藻產油的產業化提供優質種質資源。

技術領域

本發明涉及能源微藻優勢藻株的突變體篩選領域，尤其涉及索羅金小球藻合成淀粉缺陷型突變株，篩選方法及其應用。

背景技術

隨著世界人口增加，不可再生能源不斷耗盡，化石能源短缺危機已經不可避免，對可再生能源的關注已經成為熱點。藻類具有分布廣、含油脂量高、生產周期短、環境適應能力強、產率高的特點，其中微藻生物質被認為是一種最有前景的生物燃料原料。利用微藻不僅可以生產生物柴油等能源，而且還可以進行生物固碳，有利于遏制全球氣候變暖，具有廣闊的發展前景。

目前，用于大規模培養的微藻多為經篩選得到的野生型品種。由于大多數的微藻在不良環境脅迫(如高光、缺氮等)下，除了合成生物產油的前體三酰基甘油(Triacylglycerol,TAG)外，還能過量積累其他類型的儲存能量及碳源的大分子，如碳水化合物(淀粉等)，導致藻細胞積累油脂受到限制，從而造成微藻生物能源的產量及成本仍然無法滿足商業化生產的要求。

小球藻由于其生長速度快、油脂含量高，是一種具有應用潛力的能源微藻。前期我們分離得到一株能在異養條件下快速生長的索羅金小球藻(Chlorella sorokiniana GT-1)并對其異養發酵工藝進行了優化，該小球藻在發酵罐異養培養最高可達到220g/L，成功解決了在室外大規模的光生物反應器中進行生物質和油脂生產時的制種問題(參見申請人本人的在先專利申請號2015109942760)。然而，異養的種子轉到光生物反應器進行高光少氮營養元素誘導產油時發現積累油脂的速度慢，通常需要誘導2周以上的時間油脂含量才達到其最高含量(細胞干重的30％)。產油周期過長不僅增加了培養成本，還增加了感染病害的風險，同時由于生物質中含有較高含量的淀粉，導致后期油脂提取及制備工藝復雜。

利用生物技術對微藻進行遺傳改良是目前提高油脂產量的最有效的手段。誘變育種的方法包括物理誘變、化學誘變以及遺傳操作。例如，劉紅全^[1]等人利用EMS(甲基磺酸乙酯)化學誘變劑誘變小球藻，與野生型相比突變株的EPA(二十碳五烯酸)產量提高了8.97％。村上達哉^[2]等人利用EMS誘變小球藻Chlorella protothecoides，獲得光合自養缺陷型突變株，細胞密度和油脂含量比野生型分別高5.54％，6.76％。

無論采用何種方法進行能源藻種的改良，高效的篩選體系是能否成功獲得突變體的關鍵。目前直接針對油脂含量的篩選方法包括結合熒光燃料(尼羅紅)^[3]和流式分選技術^[4]，或非侵入式的技術如拉曼光譜^[5]。這些直接以細胞油脂含量為目標的篩選方法，需要專門的大型儀器設備及專人操作，難以廣泛應用。因此十分有必要建立高通量但無需專門設備、操作性強的篩選方法來輔助能源微藻的選育。

發明內容

本發明的首要技術目的是提供經篩選后得到的索羅金小球藻合成淀粉缺陷型突變株，其由于合成淀粉的相關通路部分或者少部分受阻，淀粉含量顯著降低，造成合成油脂的速率明顯加快，細胞內最高油脂含量顯著提升。

據文獻報道，在淀粉的合成與油脂積累兩個固碳機制之間，存在競爭“經光合作用合成的碳前體”的關系^[6]，因此當淀粉合成受到抑制后，通過光合作用固定的碳前體可直接進入脂肪酸合成的途徑，進而促進油脂的合成。