[發明專利]外泌體、其制備方法及其在制備治療肺癌的藥物中的應用

有效

• 申請號: 201710285865.0
• 申請日: 2017-04-27
• 公開（公告）號: CN107119015B
• 公開（公告）日: 2020-08-11
• 發明（設計）人: 賀飛;李濤;張凡;李振華;楊樂;吳東棟;滕鐵山;姬新穎
• 申請（專利權）人: 賀飛;李濤;張凡;李振華;楊樂;吳東棟;滕鐵山;姬新穎
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;A61K35/15;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種外泌體的制備方法，其包括以下步驟：

(1)培養第0天，將臍血單個核細胞按1×10⁶/ml的濃度懸浮于無血清培養基中，以1000U/ml的添加量加入人重組干擾素γ，于37℃、5％CO₂條件下進行培養；

(2)培養第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3單克隆抗體、以300U/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，刺激細胞的生長和增殖；

(3)培養第3天，半量換液并以300U/ml的添加量加入人重組白介素2；根據細胞的生長狀態，每隔一天進行半量換液，并以300U/ml的添加量補加人重組白介素2；

(4)培養第7天，半量換液并以300U/ml的添加量加入人重組白介素2、以70ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP儲存液使ATP的終濃度達到4mM；根據細胞的生長狀態，每隔一天進行半量換液，并補加300U/ml的人重組白介素2；

(5)培養第14天，在培養基中加入ATP儲存液使ATP的終濃度達到4mM，孵育30分鐘后，收獲細胞培養液的上清液并提取得到所述外泌體；

或者：

(1)培養第0天，將臍血單個核細胞按1×10⁶/ml的濃度懸浮于無血清培養基中，以1000U/ml的添加量加入人重組干擾素γ、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，于37℃、5％CO₂條件下進行培養；

(2)培養第1天，以50ng/ml的添加量加入抗CD3單克隆抗體、以300U/ml的添加量加入人重組白介素2，刺激細胞的生長和增殖；

(3)培養第3天，半量換液并以300U/ml的添加量加入人重組白介素2；根據細胞的生長狀態，每隔一天進行半量換液，并以300U/ml的添加量補加人重組白介素2；

(4)培養第7天，半量換液并以300U/ml的添加量加入人重組白介素2、以35ng/ml的添加量加入KRN7000，并加入ATP儲存液使ATP的終濃度達到4mM；根據細胞的生長狀態，每隔一天進行半量換液，并以300U/ml的添加量補加人重組白介素2；

(5)培養第14天，在培養基中加入ATP儲存液使ATP的終濃度達到4mM，孵育30分鐘后，收獲細胞培養液的上清液并提取得到所述外泌體。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其中，所述提取按照以下步驟進行：

收集20mL所述細胞培養液的上清液，于2000×g離心30min，取上清液，棄去沉淀，所述沉淀包括細胞碎片；

于4℃、10000×g離心60min，得到含外泌體的濃縮液；

將所述含外泌體的濃縮液于4℃、100000×g離心60min，收集底部沉淀；

將所得沉淀采用PBS緩沖液重懸，再次于100000×g離心60min，收集底部沉淀，即為外泌體；

將所得外泌體用2ml的PBS緩沖液重懸，采用0.22μm濾膜過濾除菌，并于-80℃儲存。