[發(fā)明專利]一種羊的長(zhǎng)絨毛及其制備方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710285306.X
• 申請(qǐng)日: 2017-04-27
• 公開（公告）號(hào): CN107164385A
• 公開（公告）日: 2017-09-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉羿羿;張東;康利平;王丙萍;荊文魁;王峰;王申元;孟凡華;劉春霞;李璐;周歡敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027;C12Q1/68
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司23211
• 代理人: 張勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種羊的長(zhǎng)絨毛及其制備方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

羊的絨毛是一種稀有的珍貴動(dòng)物纖維，羊的長(zhǎng)絨毛主要用于紡織行業(yè)，絨毛長(zhǎng)度增長(zhǎng)可以提高羊的產(chǎn)絨毛量并且在紡織過程中更便于加工。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)主要通過實(shí)際生產(chǎn)中提高絨山羊的營(yíng)養(yǎng)和改善養(yǎng)殖條件或者尋找絨毛長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)的個(gè)體進(jìn)行人工選育來培養(yǎng)絨山羊絨毛長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)的品種，但現(xiàn)有的人工選育方法增長(zhǎng)效果不大明顯。因此，若想有效改善此問題，提高絨毛的利用率和紡織性能，生物工程手段是一種可嘗試的途徑，但利用基因改造手段使羊的絨毛長(zhǎng)度顯著增長(zhǎng)的方法目前并沒有被報(bào)道。

此外，目前并未明確對(duì)羊的絨毛長(zhǎng)度起到重要作用的基因具體包括哪些基因，且現(xiàn)有的基因敲除的手段主要是RNA干擾、同源重組、talen、CRISPR/Cas9系統(tǒng)，存在因添加針對(duì)真核細(xì)胞的藥物篩選標(biāo)記而導(dǎo)致的增加出生后動(dòng)物耐藥性的風(fēng)險(xiǎn)，而且添加藥物篩選會(huì)增加細(xì)胞毒性影響胚胎后續(xù)的發(fā)育，造成克隆效率低，陽(yáng)性克隆成活率低等缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種堿基缺失的基因FGF5，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供攜帶所述FGF5基因的載體或定點(diǎn)刪除FGF5基因片段的基因編輯細(xì)胞系。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述定點(diǎn)刪除FGF5基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種羊的長(zhǎng)絨毛，所述絨山羊的FGF5基因失活而使其絨毛顯著增長(zhǎng)。

本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種制備所述長(zhǎng)絨毛的方法，是構(gòu)建無(wú)標(biāo)記基因的載體，經(jīng)過體細(xì)胞核移植，制備失活SEQ ID NO.1所示FGF5基因的克隆羊，以獲得的克隆羊生產(chǎn)長(zhǎng)絨羊毛。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述方法包括如下步驟：

(1)構(gòu)建針對(duì)真核細(xì)胞的無(wú)熒光標(biāo)記或藥物篩選標(biāo)記的FGF5基因定點(diǎn)敲除載體；

(2)將該載體轉(zhuǎn)染F5代以內(nèi)的絨山羊成纖維細(xì)胞，利用提高轉(zhuǎn)染效率、挑選單個(gè)細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，酶切鑒定，測(cè)序分析方法篩選出陽(yáng)性克?。?/p>

(3)利用體細(xì)胞核移植的方法將陽(yáng)性細(xì)胞移植到去核卵細(xì)胞中，融合、激活、發(fā)育后移植到同期母羊體內(nèi)相應(yīng)部位；

(4).基因編輯絨山羊出生后在羊毛生長(zhǎng)休止季節(jié)采集絨毛進(jìn)行絨毛長(zhǎng)度檢測(cè)；

(5)提取長(zhǎng)度增長(zhǎng)的絨毛基因，獲得目的基因。

本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)所述長(zhǎng)絨毛的羊的制備方法，所述方法是通過基因編輯技術(shù)制備攜帶堿基缺失FGF5基因的基因編輯羊。

本發(fā)明的有益效果為：

1、本發(fā)明提供了一種長(zhǎng)度增長(zhǎng)的羊絨毛，其絨毛長(zhǎng)度達(dá)101.3mm，比現(xiàn)有技術(shù)增加了6.5mm；羊毛長(zhǎng)度可達(dá)192.62mm，比現(xiàn)有技術(shù)增加了18.31mm，且傳代穩(wěn)定，妊娠率達(dá)80％以上，比現(xiàn)有技術(shù)的8.7～25％提高了至少3倍。

2、本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)的偏見，摒棄了在載體上攜帶藥物篩選標(biāo)記或熒光標(biāo)記的方法，設(shè)計(jì)了無(wú)藥物篩選和熒光標(biāo)記基因的定點(diǎn)敲除FGF5基因的載體，獲得了羊絨羊毛都顯著增長(zhǎng)的定點(diǎn)敲除FGF5基因的絨山羊，與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是實(shí)現(xiàn)了安全、定點(diǎn)、100％敲除FGF5基因，相比于傳統(tǒng)育種方法篩選長(zhǎng)絨山羊的長(zhǎng)期性和不確定性，本方法更加省時(shí)、精準(zhǔn)。與傳統(tǒng)基因編輯育種方法相比，本發(fā)明更加安全，高效，成活率更高。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的重組質(zhì)粒構(gòu)建圖。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1合成無(wú)標(biāo)記基因的載體

本研究對(duì)絨山羊FGF5的cDNA序列共設(shè)計(jì)3個(gè)TALE靶位點(diǎn)，并且這3個(gè)靶位點(diǎn)全部位于FGF5基因的第一外顯子上。即通過DNA識(shí)別模塊將TALEN元件靶向特異性的DNA位點(diǎn)并結(jié)合，在FokI核酸酶的作用下完成表1中設(shè)計(jì)的位點(diǎn)的剪切，并借助于細(xì)胞內(nèi)固有的同源定向修復(fù)(HDR)或非同源末端連接途徑(NHEJ)修復(fù)過程完成FGF5序列基因缺失。

表1 TALEN質(zhì)粒的靶位點(diǎn)

實(shí)施例2細(xì)胞轉(zhuǎn)染