[發(fā)明專利]一種禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710284707.3 | 申請日： | 2017-04-26 |
| 公開（公告）號： | CN107050448B | 公開（公告）日： | 2020-06-23 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 張毓金;嚴悌昆;謝秉超;敖艷華 | 申請（專利權(quán)）人： | 廣東漁躍生物技術(shù)有限公司;廣州漁躍生物技術(shù)有限公司;廣州博恒生物科技有限公司 |
| 主分類號： | A61K39/295 | 分類號： | A61K39/295;A61K39/235;A61K39/145;A61P31/16;A61P31/20 |
| 代理公司： | 廣州科沃園專利代理有限公司 44416 | 代理人： | 張帥 |
| 地址： | 511500 廣東省清遠市清城區(qū)石角鎮(zhèn)廣州(*** | 國省代碼： | 廣東;44 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 禽流感 病毒 二聯(lián) 疫苗 制備 方法 | ||
1.一種禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
S1細胞載體的制備：將LMH細胞用胰酶消化分散，用含5～10％新生牛血清和1000～2000單位/mL青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)2～3天，接著用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細胞2～3次，得細胞載體；
S2病毒的接種：將禽流感病毒H9亞型和禽腺病毒4型的病毒液分別按終體積1:50～1:500接種到步驟S1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附30～60min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基A，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)48～72h，出現(xiàn)80％細胞病變，得病變細胞；
S3病毒液收集：將步驟S2得到的病變細胞凍融2～3次，于4℃、5000rpm的條件下離心8～12min，分別收集禽流感病毒H9亞型上清液和禽腺病毒4型上清液，接著進行TCID50和EID50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒H9亞型病毒液和禽腺病毒4型病毒液；
S4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟S3得到的禽流感病毒H9亞型病毒液和禽腺病毒4型病毒液，得禽流感病毒H9亞型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
S5疫苗配制：
a油相制備：取92～96份白油，1～3份硬脂酸鋁，3～5份司盤-80，將白油加熱到75～85℃，接著加入司盤-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；
b水相制備：取40～50份步驟S4得到的禽流感病毒H9亞型疫苗抗原，40～50份步驟S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入3～5份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；
c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在14000～16000rpm的條件下乳化4-6min，按照每瓶250mL進行分裝，即得；
所述步驟S2中的培養(yǎng)基A包括DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還包括如下組分及其濃度：
谷氨酰胺2mmol/L、重組人胰島素6μg/mL、人血清白蛋白2mg/mL、轉(zhuǎn)鐵蛋白4μg/mL、生物素3μg/mL和生長因子14mmol/L；
所述生長因子由焦磷酸硫胺素和天麻素按質(zhì)量比5:2組成。
2.如權(quán)利要求1所述的禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
S1細胞載體的制備：將LMH細胞用胰酶消化分散，用含8％新生牛血清和15000單位/mL青鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)液在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)2天，接著用無血清DMEM培養(yǎng)液清洗細胞3次，得細胞載體；
S2病毒的接種：將禽流感病毒H9亞型和禽腺病毒4型的病毒液分別按終體積1:100接種到步驟S1得到的細胞載體中，放置37℃條件下吸附30～60min后吸棄病毒液，接著加入培養(yǎng)基A，于37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)56h，出現(xiàn)80％細胞病變，得病變細胞；
S3病毒液收集：將步驟S2得到的病變細胞凍融3次，于4℃、5000rpm離心條件下10min后，分別收集禽流感病毒H9亞型上清液和禽腺病毒4型上清液，接著進行TCID50和EID50檢測，合格后，將上述上清液分別超濾濃縮，得禽流感病毒H9亞型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液；
S4病毒滅活：采用0.1％福爾馬林滅活步驟S3得到的禽流感病毒H9亞型病毒液和禽腺病毒4型毒病毒液，得禽流感病毒H9亞型疫苗抗原和禽腺病毒4型毒疫苗抗原；
a油相制備：取94份白油，2份硬脂酸鋁，4份司盤-80，將白油加熱到78℃，接著加入司盤-80和硬脂酸鋁，攪拌溶解至透明，滅菌，得油相；
b水相制備：取48份步驟S4得到的禽流感病毒H9亞型疫苗抗原，48份步驟S4得到的禽腺病毒4型毒疫苗抗原，加入4份吐溫-80，攪拌至完全溶解，得水相；
c乳化：將步驟a得到的油相與步驟b得到的水相混合，在15000rpm的條件下乳化5min，按照每瓶250mL進行分裝，即得。
3.如權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中的LMH細胞放置轉(zhuǎn)瓶內(nèi)培養(yǎng)。
4.如權(quán)利要求1或2所述的禽流感病毒、禽腺病毒二聯(lián)滅活疫苗的制備方法，其特征在于，所述步驟S1中的LMH細胞放置微載體反應(yīng)器內(nèi)培養(yǎng)，微載體使用量為2～10g/L。
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