[發明專利]電學監測納米限域空間內酶催化動力學的裝置及方法

在審

• 申請號: 201710284139.7
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107121483A
• 公開（公告）日: 2017-09-01
• 發明（設計）人: 李延斌;傅迎春;戴煌
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N27/48
• 分類號: G01N27/48
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司33200
• 代理人: 林超

技術領域

本發明屬于一種定量檢測納米限域空間內酶活性的生物傳感技術，具體涉及一種電學監測納米限域空間內酶催化動力學的裝置及方法，利用納米孔道陣列監測酶在納米限域空間內催化沉積。

背景技術

酶是廣泛存在生物體內的活性物質，具有催化效率高、選擇性強、反應條件溫和等優點，廣泛應用于合成、催化、燃料電池等領域。多年來，水溶性酶的結構、穩定性和催化能力是通過溶解在一定成分濃度和溫度緩沖水溶液中來分析它們的結構，研究它們的催化活性。從這個角度來說，某種經純化可溶性酶的體外特性可以用來闡述酶催化特定化學反應能力及反應機制。然而，簡單緩沖溶液并不能反映酶催化通常發生在成分復雜的生物介質環境。大多數生物體內酶催化反應發生在分子擁擠的環境中或在限域空間內，如在表面上，嵌入表面，或在體積小內。因此，體內感興趣的酶在被綜合模擬時這些因素是需要被考慮的。傳統的酶活性檢測是在體外緩沖溶液中進行，無法反應酶在體內空間受限情況的催化性能。離子通道又稱為膜蛋白，嵌入細胞膜在生命活動中扮演至關重要的角色。受到蛋白質通道的啟發，固態納米通道相比生物納米通道具有良好的機械強度，通道大小可調，容易進行功能修飾的優點，近年來引起越來越多的研究興趣。在固態納米通道內檢測酶的活性可以很好地模擬酶在限域空間內的催化性能。目前現有的固態納米通道內檢測酶活性的研究方法主要是基于熒光和電化學檢測方法。

現有技術有的在檢測端粒酶活性過程中，在鉀離子存在形成G-四聯體，對通過納米孔道的指示分子產生的電化學信號進行檢測。還有的在檢測疾病相關的脂肪酸分子和醛類分子采用電化學阻抗信號變化。這些檢測方法都僅對反應前后兩種狀態的信號進行檢測，無法對酶催化反應的整個過程進行監測，不能得到酶催化動力學參數。這些檢測方法無法收集游離產物的實時信號，其檢測過程也會受到擴散和傳質影響，導致信號收集效率低。因此，結合納米通道陣列和酶催化沉積的優勢發展對酶催化過程進行簡單、靈敏地分析監測，實現對酶動力學過程進行分析具有重要的意義，為開發更為靈敏的檢測手段提供理論依據。

發明內容

本發明的目的在于針對現有技術的不足，提供了一種電學監測納米限域空間內酶催化動力學的裝置及方法。本發明中針對酶催化生成聚合物，聚合物在納米通道中沉積從而使通道的有效孔徑減小，通過適時測定通道離子電流信號來監測酶催化過程，根據得到的電流-時間信號，計算出酶催化動力學參數。

本發明的目的是通過以下的技術方案來實現的：

一、一種電學監測納米限域空間內酶催化動力學的裝置：

包括檢測池腔體和檢測電極，檢測池腔體分為進樣池腔體和滲透池腔體，進樣池腔體和滲透池腔體之間通過打孔石英片連接，所述的石英片設有中心通孔，中心通孔處安裝修飾酶的多孔陽極氧化鋁圓片，進樣池腔體和滲透池腔體的腔體上端設有檢測電極，檢測電極下端插入到進樣池腔體和滲透池腔體中。

所述的修飾酶的多孔陽極氧化鋁圓片通過環氧樹脂膠固定粘接在中心通孔的一側所述的孔端面，使得陽極氧化鋁圓片的中心和中心通孔的中心重合。

所述的石英片尺寸為20mm*20mm*0.5mm，中心通孔為直徑0.2mm～3mm的圓孔。

所述的檢測電極采用雙Ag/AgCl飽和KCl溶液電極。

所述檢測電極連接到電化學工作站。

二、一種電學監測納米限域空間內酶催化動力學的方法，包括以下步驟：

(1)在多孔陽極氧化鋁(Anodic aluminum oxide，AAO)納米孔陣列的孔壁上修飾酶；

(2)將修飾酶的多孔陽極氧化鋁納米孔陣列固定于打孔石英片的中心通孔，將打孔石英片置于進樣池和滲透池之間，制作形成檢測池；

進樣池和滲透池中均加入PBS溶液。

(3)向進樣池中加入反應底物，觸發多孔陽極氧化鋁納米孔陣列上的修飾酶發送催化反應，并在中心通孔的多孔陽極氧化鋁納米孔陣列的納米孔道中生成聚合物，形成沉淀；

(4)利用電學方法對通過多孔陽極氧化鋁納米孔陣列的納米孔道的通道電流進行實時監測，間隔采集到不同時刻的電流數據；

(5)根據采集到的電流-時間數據擬合繪制電流-時間關系曲線，作出Lineweaver-Burk圖，根據Lineweaver-Burk圖計算得到酶動力學參數。

所述的酶動力學參數包括米氏常數(K_M)和最大反應速度(V_max)。