[發(fā)明專利]用于甜瓜果實基因PCR表達分析的內(nèi)參基因及該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗證方法

在審

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• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN107227340A
• 公開（公告）日: 2017-10-03
• 發(fā)明（設計）人: 湯謐;任儉;劉曄;張娜;孫玉宏;程維舜;曾紅霞;李煜華;楊皓瓊
• 申請（專利權）人: 武漢市農(nóng)業(yè)科學技術研究院作物科學研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 武漢開元知識產(chǎn)權代理有限公司42104
• 代理人: 李滿,劉志菊

技術領域

本發(fā)明涉及植物基因工程技術領域，具體地指一種用于甜瓜果實基因PCR表達分析的內(nèi)參基因及該內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗證方法。

背景技術

基因表達分析是研究基因功能和轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的重要手段。實時熒光定量PCR(qRT-PCR)因具有高靈敏性、高特異性、高精確性和成本較低等的特點，被廣泛應用于基因表達的定量分析。在qRT-PCR分析中，為了獲得目標基因表達水平的真正差異，需要消除不同樣本RNA產(chǎn)量、質(zhì)量以及反轉(zhuǎn)錄效率上存在的差異。消除樣本間的差異通常情況下是采用內(nèi)參基因進行校正和標準化，即通過分別測定目的基因以及內(nèi)參基因的表達量，將內(nèi)參基因表達量作為一個標準來計算出目的基因的相對表達量，再比較樣品間相對表達量的差異。相對定量方法簡單、準確、高效，應用十分廣泛，但需要選擇合適的內(nèi)參基因。理想的內(nèi)參基因應該是在所有的樣本中均表達穩(wěn)定，因此，利用qRT-PCR對目標基因進行相對定量的準確性依賴于使用經(jīng)過系統(tǒng)驗證的、表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

甜瓜是葫蘆科甜瓜屬植物，是一種重要的經(jīng)濟作物。中國甜瓜收獲面積和總產(chǎn)量均居世界第一。利用基因表達分析的方法挖掘甜瓜優(yōu)異基因和調(diào)控網(wǎng)絡，是進行甜瓜遺傳改良的前提。目前在甜瓜基因表達分析中使用的多是傳統(tǒng)的內(nèi)參基因，這些傳統(tǒng)內(nèi)參基因并未經(jīng)過系統(tǒng)驗證，穩(wěn)定性較差，從而導致甜瓜基因表達分析的準確性較差。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了提高甜瓜基因表達分析的準確性，從甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中挖掘出一批表達較穩(wěn)定的基因，并進一步比較了這些基因在不同果實發(fā)育時期中的表達穩(wěn)定性，最終篩選出適于甜瓜果實基因表達分析的穩(wěn)定的內(nèi)參基因。

為實現(xiàn)此目的，本發(fā)明所設計的一種用于甜瓜果實基因PCR表達分析的內(nèi)參基因，所述內(nèi)參基因為MELO3C007745T1基因，所述內(nèi)參基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：3所示。

上述MELO3C007745T1基因的PCR擴增引物核苷酸序列是：

正向引物序列：TCTGGAGGAGTAGGTCGGATACC；

反向引物序列：CGATCAATGACGCAACAAGGCA。

一種上述內(nèi)參基因的穩(wěn)定性驗證方法，其特征在于，它包括以下步驟：

步驟1：在雪里紅甜瓜和風味4號甜瓜于授粉后的15、20、25、30和35天的五個采樣時間點，分別選取三個生物學重復的雪里紅甜瓜和三個生物學重復的風味4號甜瓜果實，每個生物學重復的雪里紅甜瓜選取兩株。每個生物學重復的風味4號甜瓜也選取兩株，即一共采集30株雪里紅甜瓜果實和30株風味4號甜瓜果實；

步驟2：用植物RNA提取試劑分別分離以上30株雪里紅甜瓜果實和30株風味4號甜瓜果實的總RNA，每個上述總RNA均需滿足A260/A280在1.8～2之間以及A260/A230在1.8～2之間；且每個上述總RNA均需要通過完整性檢測，對每個上述總RNA進行反轉(zhuǎn)錄反應得到對應的每個cDNA；

步驟3：分析雪里紅甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風味4號甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，在雪里紅甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和風味4號甜瓜果實轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分別選取如下共有核苷酸序列：

MELO3C026953T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：4、MELO3C002234T2，核苷酸序列見SEQ ID NO：5、MELO3C007745T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：3、MELO3C008016T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：6、MELO3C009005T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：7、MELO3C021785T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：8、MELO3C015496T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：9、MELO3C013938T1，核苷酸序列見SEQ ID NO：10，CmRPL和CmRPS15作為候選內(nèi)參基因；

步驟4：將上述8種候選內(nèi)參基因進行引物設計得到8種對應的引物，并保證各個引物的擴增產(chǎn)物長度控制在80-150bp之間，用上述8種引物均對每個cDNA進行常規(guī)PCR擴增得到每個cDNA對應的PCR擴增產(chǎn)物，對每個PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳檢測檢驗上述每個引物是否擴增出有效的唯一的條帶；

步驟5：將引物稀釋至不同倍數(shù)后對所有上述獲得的cDNA進行qRT-PCR實驗，以引物的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標，擴增達到閾值時的循環(huán)數(shù)Ct值為縱坐標繪制引物標準曲線，并得到引物的擴增效率和擴增達到閾值時的循環(huán)數(shù)；