[發明專利]三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測試劑盒與方法

有效

• 申請號: 201710281965.6
• 申請日: 2017-04-26
• 公開（公告）號: CN106939347B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 畢可然
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11;C12Q1/04;C12R1/63
• 代理公司: 連云港潤知專利代理事務所 32255
• 代理人: 劉喜蓮

本發明公開了一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測試劑盒，該試劑盒包括陰性對照、需鈉弧菌（Vibrio natriegens）XA1菌株DNA作陽性對照、含Mg²⁺、dNTP和DNA聚合酶的PCR緩沖液和引物對等。本發明還公開了一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測方法，該方法包括DNA模板的提取：PCR預混合液的配制和PCR擴增，擴增反應結束后電泳在紫外分析儀下觀察結果:若在308bp和526bp處出現條帶為陽性，否則為陰性。本發明具有較高的靈敏性，最低可以檢測出13.2pg的需鈉弧菌基因組DNA，操作簡單，不需要專門技術人員，而且全程時間很短，耗時少。

技術領域

本發明涉及一種病原菌的檢測試劑盒與檢測方法，特別是一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測試劑盒與檢測方法。

背景技術

需鈉弧菌是海洋微生物中常見的兼性厭氧細菌，廣泛存在于河口入海處、近海岸的海水、海底沉積物及海生動物中，是一種條件致病菌，可導致水產養殖動物患病死亡，死亡率高達87.5-100%，嚴重危害我國海水養殖業的健康發展。

目前鑒定弧菌的技術有：

1、經典的生理生化鑒定方法，該法繁瑣、耗時、且要求操作人員有良好的專業素養；

2、細菌快速自動鑒定系統，該法需要昂貴的儀器設備和技術熟練的操作人員；

3、基于核酸的檢測技術，包括DNA探針和PCR技術 (聚合酶鏈式反應技術)，相對上述檢測技術而言，該技術具有快速、簡捷、靈敏等特點。

但是，目前針對該需鈉弧菌的研究主要停留在病原的分離和實驗室鑒定，還沒有一個快速檢測方法報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的不足，提供一種新的三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測試劑盒，實現三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速、準確檢測。

本發明所要解決的另一個技術問題是提供了應用上述試劑盒進行三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測的方法。

本發明所要解決的技術問題是通過以下的技術方案來實現的。本發明是一種三疣梭子蟹病原需鈉弧菌雙重PCR快速檢測試劑盒，其特點是，該試劑合由下列物品組成：

1)陰性對照，成份為 1mL 滅菌雙蒸水 1 支 ;

2)陽性對照，試劑成份為溶于1mL滅菌雙蒸水中100ng的需鈉弧菌（Vibrio natriegens）XA1菌株DNA 1支；

3)含Mg²⁺、dNTP和DNA聚合酶的PCR緩沖液 1支；

4)引物對toxR-F/toxR-R

toxR-F為：5'-AAT CCG CTT TCC TCT GTT-3' 1支；

toxR-R為：5'-GGC GTT AGC ACA GGT ACA-3' 1支；

5)引物對Vhh-F /Vhh-R

Vhh-F：5'-AAT GTC ATC CGC CAA CGA-3' 1支；

Vhh-R：5'-CCG TCA GGC GAA TCA ATG-3' 1支；

6)滅菌雙蒸水 1支；

7)包裝盒子，一塊泡沫板，其大小與包裝盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數量的小孔，上述各小管分別對應放置于這些小孔中； 將陽性對照單獨存放；試劑盒于 -20°C保存。