[發明專利]一種提高N-乙酰神經氨酸產量的重組枯草芽孢桿菌

有效

• 申請號: 201710277428.4
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN106929461B
• 公開（公告）日: 2020-11-03
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;劉延峰;張曉龍
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/75;C12P19/26;A23L33/135;C12R1/125
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種提高N-乙酰神經氨酸產量的重組枯草芽孢桿菌，其特征在于，所述重組芽孢桿菌是通過敲除磷酸轉移酶系統葡萄糖特異性酶EIICBA組件編碼基因ptsG得到的，所述磷酸轉移酶系統葡萄糖特異性酶EIICBA組件編碼基因ptsG的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述重組芽孢桿菌是以枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB為宿主構建得到的，所述宿主是通過將氨基葡萄糖乙酰化酶編碼基因重組于Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dh Δpta::lox72基因組上進行整合表達，且將N-乙酰氨基葡萄糖異構酶編碼基因、N-乙酰神經氨酸合酶編碼基因重組于表達質粒pP43NMK上進行游離表達得到的，所述氨基葡萄糖乙酰化酶的氨基酸序列為SEQ IDNO.2，所述N-乙酰氨基葡萄糖異構酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.3，所述N-乙酰神經氨酸合酶的氨基酸序列為SEQ ID NO.4。

2.權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

1)構建敲除片段：

克隆磷酸轉移酶系統葡萄糖特異性酶EIICBA組件編碼基因ptsG兩側同源臂基因及Spectinomycin抗性基因片段，構建重組敲除片段；

2)構建高產N-乙酰神經氨酸重組枯草芽孢桿菌：

將上述重組敲除片段轉化枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis 168ΔnagP ΔnagP ΔgamP ΔgamA ΔnagAΔnagBΔ1dhΔpta::lox72；Δctc::p43-Gna1，pP43NMK-AGE-NeuB，得到高產N-乙酰神經氨酸重組枯草芽孢桿菌。

3.權利要求1所述重組枯草芽孢桿菌在制備營養保健品方面的應用。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于，所述重組枯草芽孢桿菌用于生產N-乙酰神經氨酸。

5.根據權利要求4所述的應用，其特征在于，所述生產，是將35-38℃、180-220rpm下培養10-20h的重組枯草芽孢桿菌以10％-20％的接種量轉入發酵培養基，于35-38℃、180-220rpm條件下發酵30-50h。