[發明專利]一種同時檢測鲇形目魚類四種致病菌的多重PCR引物組及監測方法

有效

• 申請號: 201710276555.2
• 申請日: 2017-04-25
• 公開（公告）號: CN106868198B
• 公開（公告）日: 2020-09-18
• 發明（設計）人: 張秧兆;熊凡;王桂堂;張露;鄒紅
• 申請（專利權）人: 揚州宏盛水產科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 揚州市蘇為知識產權代理事務所(普通合伙) 32283
• 代理人: 周全

1.一種同時檢測鲇形目魚類四種致病菌的多重PCR引物組，其特征在于，所述多重PCR引物組包括鲇愛德華氏菌引物對、柱狀黃桿菌引物對、嗜水氣單孢菌引物對和點狀氣單胞菌引物對，

所述鲇愛德華氏菌引物對的核酸序列為：

EI-F1：5’-CGGCAGGTCATATCAAAGAG-3’，

EI-R1：5’-CGATAATGTGGTAATGCGGT-3’，

所述柱狀黃桿菌引物對的核酸序列為：

FC-F2：5’-ATCCAGAACGTGTGATAGGT-3’，

FC-R2：5’-AAGTTCCAGCTACGATACCA-3’，

所述嗜水氣單孢菌引物對的核酸序列為：

AH-F3：5’-AGTTTGTCGCCAATATCCGC-3’，

AH-R3：5’-CTCGTACGCTCATGAGGACT-3’，

所述點狀氣單胞菌引物對的核酸序列為：

AP-F4：5’-CAGCTACCCCTCGACTATGG-3’，

AP-R4：5’-TGCGGATCTTGTGACTGACT-3’。

2.一種同時檢測鲇形目魚類四種致病菌的PCR檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

1）、制備DNA模板：利用DNA試劑盒抽提基因組DNA作為模板；

2）、多重PCR擴增：利用權利要求1中的多重PCR引物組對DNA模板進行多重PCR擴增；

3）、檢測：對步驟2）中得到的擴增產物作為樣品進行凝膠電泳檢測，利用TAE緩沖液配置1.2%的瓊脂糖凝膠，點樣后，電壓設置為100~140伏，電泳20~40分鐘；

若有1170bp的條帶說明樣品中有鲇愛德華氏菌，若有895bp的條帶說明樣品中有柱狀黃桿菌，若有554bp的條帶說明樣品中有嗜水氣單孢菌，若有418bp的條帶說明樣品中有點狀氣單胞菌；

上述方法用于非疾病診斷目的的檢測。

3.根據權利要求2所述一種同時檢測鲇形目魚類四種致病菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟2）中的多重PCR擴增的反應體系為：

2×mix 23～27uL，

10umol/L EI-F1 l~2uL，

10umol/L EI-R1 l~2uL，

10umol/L FC-F2 l~2uL，

10umol/L FC-R2 l~2uL，

10umol/L AH-F3 l~2uL，

10umol/L AH-R3 l~2uL，

10umol/L AP-F4 l~2uL，

10umol/L AP-R4 l~2uL，

DNA模板 l~2uL，

ddH₂O 加至50uL，

所述的2×mix包含Phusion DNA Polymerase、2×Phusion PCR Buffer、3mM MgC1₂和400uM dNTP。

4.根據權利要求2所述一種同時檢測鲇形目魚類四種致病菌的PCR檢測方法，其特征在于，所述步驟2）中的多重PCR擴增的擴增條件為：98℃預變性3~5min，98℃變性30~45s，57~60℃退火25~35s，72℃延伸50~60s，進行28-32個循環后，然后再72℃延伸7~10 min，完成PCR擴增，擴增產物4℃保存。