[發明專利]一種二肽基肽酶-4抑制肽及其制備方法與其應用

有效

• 申請號: 201710270198.9
• 申請日: 2017-04-24
• 公開（公告）號: CN106905417B
• 公開（公告）日: 2020-11-24
• 發明（設計）人: 劉睿;盛乃娟;王倩;李曉芳;陳曉鈺;吳體智;吳皓
• 申請（專利權）人: 南京中醫藥大學
• 主分類號: C07K7/08
• 分類號: C07K7/08;C12P21/06;C07K1/20;C07K1/18;A61K38/10;A61P3/10
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 楊海軍

本發明公開了一種二肽基肽酶?4抑制肽及其制備方法和應用，該抑制肽的氨基酸序列為：Phe?Asp?Phe?Trp?Asp?Gly?Arg?Asp?Gly?Glu?Val?Asp。本發明采用現代生化技術手段，對雜色蛤中的抑制二肽基肽酶的活性成分進行跟蹤篩選和評價，通過酶解、乙醇沉淀、離子交換樹脂和反相高效液相色譜法等純化方法制備得到，實驗結果表明，該抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶?4的作用，具有很好的降血糖的功效，并且安全性能好，具有很好的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種活性多肽，具體涉及一種從雜色蛤軟體酶解物中分離得到的具有抑制二肽基肽酶-4(DPP-4)活性的多肽，屬于生物醫藥技術領域。

背景技術

二肽基肽酶-4(Dipeptidylpeptidase-Ⅳ,DPP-Ⅳ)是一種絲氨酸蛋白酶，能迅速裂解和失活腸促胰島素、神經肽和細胞因子。DPP-4可特異性切斷GLP-1(胰高血糖素樣肽-1)肽鏈N端2位上的丙氨酸或脯氨酸殘基，從而使GLP-1失活。GLP-1作為一種重要的腸促胰島素，除能促進胰島素分泌及抑制胰高血糖素分泌外，還具有增加飽膩感、減緩胃排空時間、抑制胰島β細胞凋亡和促進β細胞增殖等作用。由于可被DPP-4迅速降解，GLP-1的體內半衰期極短(小于2min)，若能抑制DPP-4活性則可有效延長GLP-1的作用時間，從而有利于降低血糖水平，具有治療高血糖的作用。

現代研究表明，活性肽與蛋白質及單一氨基酸相比，具有更強的生物活性和營養價值。活性肽專屬性強、生物活性高、毒副作用小，易被消化吸收，具有多種功能，作為預防和治療疾病的醫藥產品進行研究有著巨大的開發潛力。而食源性的DPP-4抑制劑控制高血糖起效快、作用強、安全性高，目前己經在臨床治療糖尿病中發揮了重要的作用。

雜色蛤(Ruditapes philippinarum)是廣泛分布于江蘇沿海的一種重要雙殼經濟貝類。傳統中醫理論認為其貝殼和軟體部份均可入藥，蛤蜊肉咸、冷、無毒，歸胃、肝、膀胱經，宋代《嘉祐本草》中關于蛤蜊有記載：“潤五臟，止消渴，開胃，解酒毒。主老癖能為寒熱者，及婦人血塊，宜煮食之”。現代研究表明蛤蜊酶解肽具有抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性。

發明內容

發明目的：本發明的目的是在雜色蛤現有研究的基礎之上，通過大量實驗篩選，采用現代生化技術手段，對雜色蛤中的抑制二肽基肽酶活性成分進行跟蹤評價，通過酶解、乙醇沉淀、離子交換色譜和反相高效液相色譜法等純化方法制備得到一種二肽基肽酶-4的抑制肽，該抑制肽具有很好的抑制二肽基肽酶-4的作用，具有很好的抗高血糖的功效。

技術方案：為了實現以上目的，本發明采取的技術方案為：

一種二肽基肽酶-4抑制肽，該抑制肽具有下述的氨基酸序列：Phe-Asp-Phe-Trp-Asp-Gly-Arg-Asp-Gly-Glu-Val-Asp(苯丙氨酸-天冬氨酸-苯丙氨酸-色氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-精氨酸-天冬氨酸-甘氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸)。

本發明提供的二肽基肽酶-4抑制肽的制備方法，其包括以下步驟：

(1)雜色蛤酶解物的制備：

將雜色蛤軟體洗凈泥沙，加水煎煮，分離煎煮液與肉渣，瀝干；取肉渣，加3至8倍量水勻漿后，加入生物酶酶解，酶解結束后,于沸水浴滅活，然后加入無水乙醇進行醇沉，靜置，再離心取上清液，濃縮，冷凍干燥，得到凍干粉；

(2)離子交換色譜純化：

取步驟(1)酶解得到的凍干粉，用去離子水溶解后，經離子交換色譜分離，流動相：A相為水，B相為0.8mol/L的氯化鈉溶液，梯度洗脫，流速：2mL/min；檢測波長：220nm；經過離子交換色譜分離得到不同組分的酶解物，分別測定各組分對二肽基肽酶-4的抑制活性，取活性最好的部分，冷凍干燥，得凍干粉；

(3)反向色譜分離純化：