[發明專利]基于微液滴數字PCR技術的HBV核酸定量檢測系統

在審

• 申請號: 201710268539.9
• 申請日: 2017-04-23
• 公開（公告）號: CN108342507A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 雷孟平;祝令香;朱宏艷;郭永;楊文軍;王勇斗
• 申請（專利權）人: 北京天健惠康生物科技有限公司;新羿制造科技（北京）有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.基于微液滴數字PCR技術的HBV核酸定量檢測系統，其包括：

1)用于擴增乙型肝炎病毒DNA的上游引物和下游引物，其分別源于乙型肝炎病毒PreS和S區保守區域；檢測乙型肝炎病毒DNA的特異探針，其源于乙肝病毒表面抗原S基因的保守區域；

2)非感染的線性化雙鏈質粒的質控標準品和檢測所述質控標準品的探針；所述探針序列與所述乙型肝炎病毒DNA的特異探針組合無交叉反應，和使用與擴增乙型肝炎病毒DNA共同的引物序列，以減少引物之間的相互干擾；和

3)PCR反應緩沖液，其包含脫氧核糖核苷三磷酸dATP、dCTP、dGTP和dUTP，其中dATP、dCTP、dGTP的終濃度均為100-400nmol/L，dUTP終濃度為300-1000nmol/L；以及0.1-1.5UUNG，1-10U/μl DNA聚合酶。

2.根據權利要求1的所述HBV核酸定量檢測系統，所述上游引物HBV-F序列為SEQ IDNO.1：5'-GTRTCTGCGGCGTTTTATCA-3'，和所述下游引物HBV-R序列為SEQ ID NO.2：5'-GGACAAACGGGCAACATACC-3'；所述上游引物和所述下游引物下游的終濃度為50-2000nM。

3.根據權利要求1的所述HBV核酸定量檢測系統，檢測乙型肝炎病毒DNA的特異探針為SEQ ID NO.3：5'-ATCCTGCTGCTATGCCTC-3'；和所述乙型肝炎病毒DNA的特異探針的終濃度為50-2000nM。

4.根據權利要求3的所述HBV核酸定量檢測系統，所述檢測乙型肝炎病毒DNA的特異探針的羧基端用FAM標記，羥基端用無熒光的猝滅基團NFQ修飾，通過MGB基團增強探針穩定性，提高探針Tm值。

5.根據權利要求1的所述HBV核酸定量檢測系統，所述質控標準品序列為SEQ ID NO.4：

AAACGGCGGCCGGCGGCCGGGAGGAGGGCTCGTAGATGTGTCTGCGGCGTTTTATCAAGTCCACCTCGAACGGACTGATCACTGATGGAGTGGGCGTACAGCGGCGGCGGCCAGGTATGTTGCCCGTTTGTCCTCCATGACGGTGTCGTCGGCGCCGCCCAAGCGGCGGGCGGGGAGGACCAAGGTCAGGGAGACGAGGCACCCGGTGTACAAGGGGGTGCGCAGCAGGAACCCCGGCCGGTGGGTCTGCGAGGTGCGCGAGCCGCACGGGAAGCAGCGGCTGTGGCTCGGCACCTTCGA；

檢測質控標準品序列的特異探針為SEQ ID NO.5：5’-CACCTCGAACGGACTG-3’；

所述檢測質控標準品序列的特異探針與用于擴增乙型肝炎病毒DNA引物探針組合無交叉反應；其使用與擴增乙型肝炎病毒DNA共同的引物序列；

和所述檢測質控標準品序列的特異探針的終濃度為50-2000nM。

6.根據權利要求5的所述HBV核酸定量檢測系統，所述檢測質控標準品序列的特異探針羧基端用VIC標記，羥基端用無熒光的猝滅基團NFQ修飾，通過MGB基團增強探針穩定性，提高Tm值。

7.根據權利要求1的所述HBV核酸定量檢測系統，所述PCR反應緩沖液還包含25-100mmol/L Tris.HCl,5-25mmol/L氯化鉀，1-10mmol/L硫酸銨，和0.5-5mmol/L氯化鎂。

8.根據權利要求1的所述HBV核酸定量檢測系統，所述PCR反應緩沖液還包含60-80mmol/L Tris.HCl,8-15mmol/L氯化鉀，3-6mmol/L硫酸銨，和1.5-3mmol/L氯化鎂。