[發(fā)明專利]一種新型CpGISS疫苗佐劑的制備方法與應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710267443.0
• 申請(qǐng)日: 2017-04-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN107137706A
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡向東;葉茂;梁新樂(lè);邵建忠
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江皇冠科技有限公司
• 主分類號(hào): A61K39/39
• 分類號(hào): A61K39/39;C12P19/36;C12R1/84
• 代理公司: 北京華仲龍騰專利代理事務(wù)所(普通合伙)11548
• 代理人: 李靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及疫苗佐劑制備技術(shù)領(lǐng)域，具體是一種新型CpGISS疫苗佐劑的制備方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

國(guó)內(nèi)眾多疫苗生產(chǎn)企業(yè)的疫苗佐劑均是用鋁佐劑或油佐劑，但該類佐劑有一定的副作用，油乳劑刺激局部產(chǎn)生肉芽腫或炎癥反應(yīng)：鋁佐劑可以引起注射部位局部炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起肉芽腫，個(gè)別的引起注射對(duì)象應(yīng)激性反應(yīng)導(dǎo)致個(gè)別個(gè)體死亡。且誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答是屬于 Th2 型的，不足以起到完全的保護(hù)動(dòng)物防感染的作用。雖然能增強(qiáng)體液免疫，抗體以IgGⅠ類為主，不能明顯地提高細(xì)胞介導(dǎo)免疫應(yīng)答，不能增強(qiáng)細(xì)胞免疫，有局限性；還可能對(duì)動(dòng)物體的神經(jīng)系統(tǒng)造成傷害。主要適用于免疫能力強(qiáng)和可大量生產(chǎn)的抗原。因此制備安全高效的新型疫苗佐劑是非常必要的。

含有特定非甲基化的胞嘧啶鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸 (CpG基序) 的寡核苷酸，即CpG ISS (CpGimmunostimulatory sequences) 是近年發(fā)現(xiàn)的被哺乳動(dòng)物的免疫系統(tǒng)識(shí)別為“危險(xiǎn)”信號(hào)的新型免疫增強(qiáng)劑，能激活人體和許多動(dòng)物的先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)。在多種動(dòng)物模型上，已證實(shí)CpG ISS 可作為疫苗佐劑 ( 包括人用疫苗 )，而且與傳統(tǒng)疫苗相比，可以較大程度減少疫苗抗原的使用量，因而過(guò)敏反應(yīng)的可能性大幅度降低，部分已進(jìn)入人體的二期臨床研究 (Murad 和 Clay，2009 ；Vollmer 和 Krieg，2009)。

由于 CpG ISS 是一種安全的佐劑，多次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證實(shí)高達(dá) 100 倍常規(guī)劑量的CpG ISS 注射小鼠未發(fā)現(xiàn)明顯的急性毒性作用，反復(fù)注射CpG ISS 可為長(zhǎng)期預(yù)防傳染性病原體提供一種安全的方法 (Klinman 等，1999)。CpG ISS 作為佐劑，可以誘導(dǎo) Th1 型免疫應(yīng)答，提升細(xì)胞免疫應(yīng)答的水平，還具有降低疫苗的使用量，減少過(guò)敏反應(yīng)等的優(yōu)點(diǎn)。

但是，目前尚沒(méi)有將 CpG 直接應(yīng)用到動(dòng)物的疫苗免疫產(chǎn)品，主要原因在于其存在穩(wěn)定性不強(qiáng)，時(shí)間長(zhǎng)存放易降解，導(dǎo)致藥效下降；保存條件較苛刻，要求在 -20℃下等問(wèn)題。

現(xiàn)有技術(shù)如授權(quán)公告號(hào)為CN102631675B的中國(guó)發(fā)明專利，公開(kāi)了一種高效 CpG 制劑及其制備方法和應(yīng)用。CpG 制劑中各組分的組成比例為：濃度為 10 ～ 45μg/ml 的 CpG ISS 的 PBS 溶液80～120ml ；白油160～180ml ；Span-80 10～14ml；Tween-80 6～10ml；EMULSIGEN20～40ml。該方法制備CpG ISS采用人工合成的方式，成本高且效率低；制備的CpG 制劑難以進(jìn)入細(xì)胞，容易被核酸酶降解，從而失去活性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種能得到極易進(jìn)入細(xì)胞，穩(wěn)定性好，安全性高，生物相容性好，生物學(xué)活性強(qiáng)的新型CpGISS疫苗佐劑的制備方法與應(yīng)用。

本發(fā)明針對(duì)背景技術(shù)中提到的問(wèn)題，采取的技術(shù)方案為：

本發(fā)明采用的菌種被鑒定為巴斯德畢赤酵母（pichia pastoris）保藏號(hào)為CGMCC NO.6368，于2012年7月20號(hào)保藏于位于北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)的中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心（CGMCC）中。

一種新型CpGISS疫苗佐劑的制備方法，制備步驟為：