[發(fā)明專利]幾丁質結合蛋白Bt?CBP及其編碼基因和制備方法與應用

在審

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• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107098953A
• 公開（公告）日: 2017-08-29
• 發(fā)明（設計）人: 蔡峻;張娜;李蓬飛;陳月華
• 申請（專利權）人: 南開大學
• 主分類號: C07K14/32
• 分類號: C07K14/32;C12N15/70;A01N37/46;A01P3/00;C12Q1/34
• 代理公司: 天津佳盟知識產權代理有限公司12002
• 代理人: 侯力

技術領域

本發(fā)明涉及一種來源于蘇云金芽胞桿菌的幾丁質結合蛋白及其編碼基因和制備方法和應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

幾丁質,俗稱甲殼素、甲殼質,是N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)的多聚物,在自然界中，幾丁質是含量僅次于纖維素的生物高分子物質。幾丁質的降解主要是通過產幾丁質酶的微生物完成。

微生物幾丁質降解系統(tǒng)主要由內切幾丁質酶、外切幾丁質酶、乙酞己糖胺酶和與幾丁質結合蛋白等組成。其中幾丁質結合蛋白(chitin-bindingproteins，CBP)分散幾丁質糖鏈，內切幾丁質酶隨機切割多糖鏈，生成幾丁質寡糖；外切幾丁質酶沿糖鏈末端降解幾丁質，生成的幾丁二糖在β-N-乙酰己糖胺酶或殼二糖酶作用下生成單糖。其中幾丁質結合蛋白是一類能與幾丁質特異結合的蛋白質,能起到分散幾丁質糖鏈束的作用,對于不溶多糖降解起著決定性的作用，廣泛存在于各種微生物、動物和植物中。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是目前世界上研究最深入、應用最成功的殺蟲細菌，已經廣泛用于農業(yè)、林業(yè)、貯藏以及衛(wèi)生等多種害蟲的防治。它除了能產生殺蟲晶體蛋白之外，還能產生包括幾丁質酶、幾丁質結合蛋白在內的多種活性物質。但是目前人們對于蘇云金芽胞桿菌幾丁質酶和幾丁質結合蛋白的認識還有限,這些因素對于蘇云金芽胞桿菌及其幾丁質酶、幾丁質結合蛋白的應用造成限制。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是要解決蘇云金芽胞桿菌殺蟲性能好，但抑制真菌病害能力較差的問題，提供一種來源于蘇云金芽胞桿菌、具有高效抗病原真菌活性且制備方法簡單的幾丁質結合蛋白Bt-BCP及其編碼基因和制備方法與應用。

技術方案：

一種幾丁質結合蛋白Bt-CBP，具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。其氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示，由463個氨基酸組成。

幾丁質結合蛋白Bt-CBP的制備方法，步驟如下：

(1)DNA序列擴增：以蘇云金芽胞桿菌ATCC-35866菌株基因組為模板,以Up1和Dn1為上、下游引物，用高保真TransStartFastPfu DNAPolymeras進行PCR擴增；所述上游引物1如SEQ IDNo.3所示，下游引物Dn1，如SEQ IDNo.4所示。所得擴增片段的序列如No.5所示。

(2)一步法構建大腸桿菌表達質粒：使用全式金的無縫連接試劑盒，將所得擴增片段與NcoI和Xho I酶切后的pET28a(+)線性片段，按5:1的比例混合于PCR管中，50℃反應15～30min，之后將重組產物直接用于轉化大腸桿菌DH5ɑ，通過菌落PCR、酶切篩選鑒定陽性轉化子克隆,得到重組表達質粒pET28(+)Bt-CBP；

(3)構建大腸桿菌重組表達菌株：將重組表達質粒pET28(+)Bt-CBP轉化至大腸桿菌BL21,挑選陽性轉化子克隆,得到重組表達菌株E.coli Bt-CBP；

(4)幾丁質結合蛋白Bt-CBP的誘導表達：將重組表達菌株E.coli Bt-CBP接入含30μg/ml卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,于37℃過夜培養(yǎng)活化后,然后按1％的接種量接種到含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中,當OD₆₀₀達到0.6左右時，加入終濃度為1mM的IPTG誘導劑,在25℃，180rpm條件下誘導培養(yǎng)8-12h；

(5)幾丁質結合蛋白Bt-CBP的純化：將步驟(4)經誘導的菌液移入干凈的離心管中，4℃，離心收集菌體,用緩沖液洗滌菌體,再用緩沖液重懸菌體之后置于冰上超聲破碎，破碎后的樣品于4℃下離心，收集上清即為粗蛋白；粗蛋白用鎳柱進行親和層析純化,得到幾丁質結合蛋白。

本發(fā)明同時提供了上述幾丁質結合蛋白在增強幾丁質酶酶活性中的應用。

本發(fā)明還提供了所述的幾丁質結合蛋白單獨或與幾丁質酶聯(lián)合使用，在防治真菌病害中的應用。所述的真菌病害為黃瓜灰霉病菌或尖孢鐮刀菌等真菌病害。

本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果：

本發(fā)明的積極效果是：

1.本發(fā)明首次從蘇云金芽胞桿菌中克隆出幾丁質蛋白的編碼基因,通過構建原核表達載體獲得了具有高活性的表達產物,制備過程簡單,為幾丁質蛋白的后續(xù)研究提供了簡便方法。

2.本發(fā)明獲得的幾丁質結合蛋白Bt-CBP可以提高幾丁質酶Bt ChiB的酶活3.6倍。