[發(fā)明專利]一種制備含有多個(gè)重復(fù)單元DNA長探針的方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201710265076.0 | 申請日： | 2017-04-21 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN108728430B | 公開（公告）日： | 2022-04-05 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 郭海燕;黃妙玲;王偉偉 | 申請（專利權(quán)）人： | 胤安國際（遼寧）基因科技股份有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12N15/10 | 分類號(hào)： | C12N15/10 |
| 代理公司： | 沈陽科苑專利商標(biāo)代理有限公司 21002 | 代理人： | 李穎;周秀梅 |
| 地址： | 110169 遼寧*** | 國省代碼： | 遼寧;21 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 制備 含有 重復(fù) 單元 dna 探針 方法 | ||
本發(fā)明涉及寡核苷酸探針制備，具體涉及一種制備含有多個(gè)重復(fù)單元DNA長探針的方法。采用平末端內(nèi)切酶和切刻內(nèi)切酶同時(shí)切割含有多個(gè)重復(fù)單元DNA雙鏈的質(zhì)粒，而后利用lambda外切酶的作用原理進(jìn)行特異性切割，切割后通過電泳分離即得到含有多個(gè)重復(fù)單元的目的單鏈DNA。本發(fā)明方法適用于制備所有序列成分的DNA探針，尤其是針對難以進(jìn)行PCR擴(kuò)增的序列，如含有多個(gè)重復(fù)單元的，且所制備的探針長度可達(dá)800nt，解決了多重復(fù)單元DNA長探針制備的技術(shù)問題。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及寡核苷酸探針制備，具體涉及一種制備含有多個(gè)重復(fù)單元DNA長探針的方法。
背景技術(shù)
Lambda核酸外切酶是一個(gè)高度持續(xù)性從雙鏈DNA 5′-3′端選擇性切割磷酸化單鏈的核酸外切酶。Lambda核酸外切酶的最適底物是5′磷酸化的平末端雙鏈DNA，它以3′端核酸鏈為模板，從DNA的5′末端開始按順序進(jìn)行切割，在兩端中央位置形成單鏈【1】。Lambda核酸外切酶的另一特點(diǎn)是不能從nick(切刻)位點(diǎn)及gap位點(diǎn)的5′端開始切割【2】。
分支DNA信號(hào)放大技術(shù)(branched-DNA,bDNA)是Chiron公司推出的一種的核酸雜交信號(hào)放大技術(shù)，該檢測方法具有高靈敏度，非擴(kuò)增等特點(diǎn)【3】。目前主要應(yīng)用于HPV,HBV,HCV,HIV等病毒的檢測，基因表達(dá)分析以及腫瘤基因分析等方面。
分支DNA信號(hào)放大技術(shù)在雜交檢測過程中主要用到以下這幾種探針： CP(captμreprobe)-固定在微孔板上，用于捕獲目的序列；CE(capt μ re extender)-一端與CP所捕獲的目標(biāo)序列結(jié)合，另一端與preamplifier 結(jié)合；preamplifier-預(yù)放大分子，一端與CE結(jié)合，其他部分由5-15個(gè)重復(fù)單元組成，amplifier-結(jié)構(gòu)與preamplifier相似，但序列不同，一端與preamplifier的重復(fù)單元結(jié)合，其他位點(diǎn)與標(biāo)記探針結(jié)合。通過多級(jí)雜交，實(shí)現(xiàn)對目的序列的信號(hào)放大。
現(xiàn)階段分支DNA信號(hào)放大技術(shù)所涉及多重復(fù)單元DNA探針，其本質(zhì)是含有多個(gè)約20nt重復(fù)單元的單鏈DNA。
多重復(fù)單元序列在進(jìn)行PCR的過程中會(huì)發(fā)生錯(cuò)位配對現(xiàn)象，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物長短不一，因此，含有PCR擴(kuò)增過程的探針制備方法均不適用于多重復(fù)單元探針的制備。
而且多重復(fù)單元的DNA在PCR過程中容易出現(xiàn)錯(cuò)位退火導(dǎo)致無法擴(kuò)增出目的產(chǎn)物，因此不能使用帶有PCR過程的探針制備方法來制備含有重復(fù)單元DNA探針。目前制備多重復(fù)單元探針的方法主要是通過核酸合成儀合成，但其合成受長度限制，只能合成約100nt的探針，且得率隨探針長度增加而降低。一些商業(yè)化的生物技術(shù)服務(wù)公司，如生工生物工程 (上海)股份有限公司http://www.sangon.com，金斯瑞生物科技有限公司http://www.genscript.com，所提供的單鏈DNA合成服務(wù)長度只能達(dá)到約130nt。探針長度不足會(huì)影響preamplifier和amplifier中重復(fù)單元的數(shù)目，嚴(yán)重限制了bDNA結(jié)構(gòu)的放大倍數(shù)。為了提高preamplifier 和amplifier中重復(fù)單元的數(shù)目，有文獻(xiàn)通過搭橋連接的方法，將3條長度分別為86nt,79nt和73nt的探針拼接在一起，獲得了一條239nt的多重復(fù)單元探針【4】，但是隨著拼接片段的數(shù)目增加，連接效率會(huì)大大降低，依然受到長度的制約。
1.An Exonuclease Induced by BacteriophageλJOHN W.LITTLE,I.R. LEHMAN,AND A.D.KAISER From the Department of Biochemistry, Stanford UniversitySchool of Medicine,Palo Alto,California 94304.
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