[發(fā)明專利]克隆目標(biāo)DNA片段的方法及載體

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710264591.7
• 申請(qǐng)日: 2017-04-21
• 公開（公告）號(hào): CN108728468B
• 公開（公告）日: 2022-02-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 苗靳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南通大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/66
• 分類號(hào): C12N15/66;C12N15/65;C12N15/63
• 代理公司: 北京志霖恒遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11435
• 代理人: 郭棟梁

本發(fā)明提供了克隆目標(biāo)DNA片段的方法及載體，所述方法包括：識(shí)別位于目標(biāo)DNA片段的一側(cè)的CRISPR?Cas9識(shí)別位點(diǎn)以及分別位于所述目標(biāo)DNA片段兩側(cè)的整合位點(diǎn)和第一重組位點(diǎn)，所述第一重組位點(diǎn)位于所述目標(biāo)DNA片段與所述CRISPR?Cas9識(shí)別位點(diǎn)的之間；將整合位點(diǎn)、識(shí)別位點(diǎn)以及第一重組位點(diǎn)克隆到載體中，將spacer序列整合到所述載體上sgRNA序列的5’端；通過同源重組將將所述載體整合到所述目標(biāo)DNA片段所在的遺傳物質(zhì)上；誘導(dǎo)所述陽性克隆的Cas9編碼序列的表達(dá)，切割產(chǎn)生的片段兩端的兩個(gè)第一重組位點(diǎn)之間發(fā)生同源重組；篩選攜帶所述目標(biāo)DNA片段的質(zhì)粒。本發(fā)明的方法步驟簡(jiǎn)單，成本低，效率高，特別適用從生物體中克隆大的目標(biāo)DNA片段。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種克隆目標(biāo)DNA片段的方法及載體。

背景技術(shù)

基于CRISPR(成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列，Clustered Regularly InterspacedSmall Palindromic Repeats)/Cas9系統(tǒng)的基因組編輯方法已經(jīng)深刻的改變了生命科學(xué)領(lǐng)域的研究方法和研究?jī)?nèi)容。CRISPR/Cas9系統(tǒng)是原核生物中廣泛存在的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)之一，用于應(yīng)對(duì)外源核酸分子入侵，例如降解噬菌體來源的核酸分子，降解轉(zhuǎn)化入細(xì)胞中的外源質(zhì)粒等。當(dāng)細(xì)胞被首次入侵之后，部分外源DNA序列被捕獲，以間隔子(spacer)形式有規(guī)律的整合，成為CRISPR序列。為了精確區(qū)分自身和外源的DNA分子，外源的DNA分子中spacer序列下游(5’-3’方向)存在PAM(Protospacer Adjacent Motif)基序5’-NGG-3’。當(dāng)細(xì)胞遭遇二次攻擊時(shí)，這段序列會(huì)轉(zhuǎn)錄為非編碼RNA——crRNA(CRISPR RNA)。在CRISPR II型系統(tǒng)中，還存在一個(gè)非編碼RNA——tracrRNA與crRNA結(jié)合，其被加工，然后指導(dǎo)唯一的蛋白酶Cas9尋找spacer序列和PAM序列，切割二次攻擊的DNA雙鏈分子。為了便于載體構(gòu)建，crRNA:tracrRNA雙元分子可以融合為單個(gè)的RNA分子——sgRNA(single guide RNA)，其5’端的20nt是spacer，負(fù)責(zé)識(shí)別特定基因的區(qū)域。這樣只要同時(shí)表達(dá)Cas9蛋白和sgRNA就有可能實(shí)現(xiàn)基因組編輯。與其他類型的CRISPR系統(tǒng)相比，II型系統(tǒng)結(jié)構(gòu)更緊湊。對(duì)于CRISPR/Cas9系統(tǒng)，只需要設(shè)計(jì)不同的RNA序列即可實(shí)現(xiàn)針對(duì)特異位點(diǎn)的識(shí)別和切割。

目前定向克隆大片段DNA的方法中，已經(jīng)有報(bào)道在體外嘗試使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，類似于限制性內(nèi)切酶的作用，將目標(biāo)片段從基因組DNA中分離出來。這種方法的缺點(diǎn)在于過分依賴體外制備的高質(zhì)量、文庫構(gòu)建級(jí)別的基因組DNA。由于制備高質(zhì)量基因組DNA的技術(shù)需要豐富經(jīng)驗(yàn)，常規(guī)實(shí)驗(yàn)室往往無法便捷的使用。因此，直接從生物體內(nèi)克隆大片段DNA到載體上就成為一種很有優(yōu)勢(shì)的選擇。然而，目前已經(jīng)報(bào)道的直接從體內(nèi)克隆大片段DNA的方法都是基于位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)，需要將重組酶識(shí)別位點(diǎn)預(yù)先整合到目標(biāo)DNA片段的兩側(cè)，然后誘導(dǎo)重組酶表達(dá)使目標(biāo)DNA片段環(huán)出。這種方法的缺點(diǎn)是需要經(jīng)過反復(fù)的遺傳操作，時(shí)間成本較大。

發(fā)明內(nèi)容

現(xiàn)有技術(shù)中克隆大片段DNA時(shí)，過分依賴體外制備的高質(zhì)量、文庫構(gòu)建級(jí)別的基因組DNA，所以成本較高、技術(shù)復(fù)雜、效率較低。此外，體內(nèi)克隆的方法需要多步遺傳操作導(dǎo)入位點(diǎn)特異性重組酶的識(shí)別位點(diǎn)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。