[發明專利]球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途

在審

• 申請號: 201710264342.8
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107006523A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發明（設計）人: 范艷華;李燕伶;裴炎;李先碧;金丹
• 申請（專利權）人: 西南大學
• 主分類號: A01N63/04
• 分類號: A01N63/04;A01P3/00;C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 成都行之專利代理事務所(普通合伙)51220
• 代理人: 吳興偉

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，尤其是涉及球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途。

背景技術

植物病害是嚴重危害農業生產的自然災害之一，發生于植物生長的各個時期，各個生長部位，種類繁多，形成危害的因素復雜(張越等,2015)。化學防治是目前農業生產上解決植物病害所采取的主要措施，具有見效快、殺菌譜廣、成本低、使用簡便等優點(吳金平等,2009)。但是隨著時間的推移，化學防治也逐漸的暴露出很多弊端，如長期使用同一類農藥造成的定向選擇，使防治對象產生抗藥性，從而降低或失去防治效果；而且使用不易降解的農藥造成糧食、果品、土壤、水域殘留量超標，嚴重污染環境，威脅人類健康；除少數幾種農藥有選擇性外，多數化學農藥對害蟲及其天敵都有較大的殺傷作用，長期使用此類農藥會削弱天敵環。

針對農業方面的這種現狀，人們迫切需要尋找一種對人類和環境無害并具有良好防治效果的植物病害防治方法。選育抗病品種是防治植物病害最經濟、最有效的途徑，人類己利用植物抗病品種控制了多種大范圍流行的毀滅性病害。利用抗病品種還可以避免或減輕因過分倚重農藥而出現的耐藥和環境污染問題，但是這種方法育種年限長。而轉基因育種則能夠對具體基因進行操作和選擇，不受物種的限制，擴大可利用的基因范圍，大大地提高植物品種改良的效率(劉珊,2012)。隨著生物技術的迅猛發展，轉基因技術得到廣泛應用，為農作物病害的防治開辟了新的道路。而轉基因技術的關鍵是表達什么基因能夠提高植物的抗病能力。

植物病原真菌的細胞壁主要由幾丁質、甘露聚糖、葡聚糖等組成。有研究指出，植物病原真菌在侵入植物的過程中，為了躲避植物幾丁質酶對胞壁幾丁質的降解，會將幾丁質轉化為脫乙酰幾丁質(Kouzaytai Y et al.,2012)。因此，在植物中導入脫乙酰幾丁質酶基因，利用脫乙酰幾丁質酶對入侵真菌胞壁的降解，可提高植物對對真菌病害的抗性。此外，脫乙酰幾丁質酶降解脫乙酰幾丁質后產生的脫乙酰幾丁質寡聚體，可誘導植物自身的防御反應，比如氣孔關閉(Lee S et al.,1999)、木質化作用(Vander P et al.,1998；Moerschbacher B M et al.,1988)、病原相關(PR)基因的表達等(Jabs T et al.,1997)。因此發掘高效降解脫乙酰幾丁質的水解酶，利用其提高植物的抗病能力是植物抗病基因工程研究的一個重要領域。球孢白僵菌是一種國內外應用廣泛的昆蟲病原真菌。除致病昆蟲外，球孢白僵菌還是一種重要的植物內生菌，可提高植物的抗病能力。體外實驗表明，來自球孢白僵菌的水解酶，如幾丁質酶、蛋白酶等被認為與拮抗植物病原真菌的能力相關。

發明內容

本發明要解決的技術問題為防治植物病原真菌提供一種新選擇。

本發明提供了球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶BbCSN在防治植物病原真菌中的用途。

具體的，所述的球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

具體的，所述的球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶的編碼基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

具體的，所述的植物病原真菌為毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉。

本發明還提供一種植物病原真菌抑制劑，其主要活性成分為球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶BbCSN。

其中，所述的植物病原真菌為毛霉菌、稻瘟病菌或灰葡萄孢霉菌。

本發明還提供了表達球孢白僵菌脫乙酰幾丁質酶BbCSN的載體的構建方法，包括如下步驟：

a、設計引物擴增BbCSN，T/A克隆，進行驗證；

b、雙酶切驗證為陽性的轉化子和表達載體骨架，然后回收BbCSN片段和載體骨架片段，連接，驗證；

c、驗證正確的表達載體轉入根癌農桿菌。

具體的，步驟a中的引物序列具有如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列。

本發明的有益效果：本發明公開了一種具有抑制植物病原真菌生長的脫乙酰幾丁質酶BbCSN基因，來源于昆蟲病原真菌球孢白僵菌。將該BbCSN基因轉入煙草后，與野生型煙草葉片總蛋白相比，轉基因煙草葉片總蛋白對毛霉及灰葡萄孢霉孢子萌發均有抑制作用，對稻瘟病菌及灰葡萄孢霉菌絲的生長抑制作用較野生型強。本發明為植物病害的防治提供了有效的抗性基因，具有廣闊的應用前景。

附圖說明