[發(fā)明專利]用于微生物檢測的方法和系統(tǒng)

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710263366.1
• 申請日: 2013-02-21
• 公開（公告）號: CN107422115A
• 公開（公告）日: 2017-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·L·安德森;A·J·肯拉德;S·E·埃里克森;J·S·吉爾;B·B·霍普金斯
• 申請（專利權(quán)）人: 美國控股實驗室公司
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/58;G01N33/543
• 代理公司: 中國國際貿(mào)易促進委員會專利商標事務(wù)所11038
• 代理人: 劉曉東

本申請是申請日為2013年2月21日、發(fā)明名稱為“用于微生物檢測的方法和系統(tǒng)”的中國發(fā)明專利申請No.201380019483.3的分案申請。

本申請要求2012年2月21日提交的美國臨時專利申請61/601,231的優(yōu)先權(quán)。將美國臨時專利申請61/601,231的公開內(nèi)容通過引用整體并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于微生物的檢測的方法和系統(tǒng)。

背景

在生物樣品和基于食品的樣品中細菌和其它微生物的檢測上存在強烈的興趣。細菌病原體可在人和家養(yǎng)動物中引起高發(fā)病率以及巨大經(jīng)濟損失。同樣地，鑒于因攝入被某些微生物例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門菌屬某些種(Salmonella spp.)污染的食品而引起的威脅生命或致命的疾病的爆發(fā)，微生物的檢測在食品和藥物管理局(FDA)內(nèi)具有高度優(yōu)先權(quán)。

用于細菌檢測的常規(guī)微生物測試依賴于非選擇性和選擇性富集培養(yǎng)物，隨后將其涂板在選擇性培養(yǎng)基上，進一步測試以確認懷疑的菌落。這樣的方法可能需要數(shù)天。多種快速法已被研究，并被引入實踐來減少所需時間。然而，這些方法具有缺點。例如，牽涉直接免疫測定或基因探針的技術(shù)通常需要富集步驟以獲得足夠的靈敏度。聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)測試還包括擴增步驟，從而能夠具有高度靈敏度和選擇性，然而，可經(jīng)濟地接受PCR測試的樣品尺寸是有限的。對于稀釋的細菌懸浮液，大多數(shù)小的次級樣品不含細胞，從而仍然需要富集步驟。生物富集所需時間取決于樣品中靶細菌群體的生長速率、樣品基質(zhì)的作用以及需要的靈敏度。例如，用于產(chǎn)Vero毒素大腸桿菌(verotoxigenic E.coli)的磁性捕獲PCR系統(tǒng)在模型系統(tǒng)中需要約5、7和10小時的富集培養(yǎng)以分別檢測1000、100和1個菌落形成單位/毫升(cfu/ml)，以及在絞牛肉中需要15小時的富集培養(yǎng)來檢測1cfu/克(g)。實際上，大多數(shù)高靈敏度方法使用過夜溫育，總共花費約24小時。因培養(yǎng)所需時間，這些方法可花費達3天的時間，這取決于待鑒定的生物和樣品來源。該延滯時間通常是不適合的，因為污染的食品、水(或其它產(chǎn)品)可能已進入家畜或人中。此外，耐抗生素菌的增加和生物防御考慮使得水、食品和臨床樣品中的細菌病原體的快速鑒定在世界上成為關(guān)鍵的優(yōu)先事項。

因此，存在對微生物例如細菌和其它潛在病原性微生物的更快速的、簡單靈敏的檢測和鑒定的需要。

發(fā)明概述

在一個方面，本發(fā)明利用用于檢測樣品中的微生物的微生物生物學(xué)?？墒褂帽疚闹忻枋龅姆椒z測多種微生物。

例如，在一個實施方案中，本發(fā)明包括使用多個存在于單個微生物中的核糖體作為檢測存在于樣品中的低水平微生物的工具的方法和系統(tǒng)。例如，所述方法可包括如下步驟：將微生物與樣品中的其它組分分離，裂解微生物以釋放存在于微生物中的核糖體；和檢測核糖體或核糖體的組分，其中核糖體或核糖體的組分的檢測表明微生物存在于樣品中。在某些實施方案中，可使用基于珠粒的擴增免疫測定法來測定從微生物釋放的核糖體和/或核糖體蛋白。在其它實施方案中，本發(fā)明可包括與炭黑納米條形碼(nanostring)組合以檢測從微生物釋放的核糖體和/或核糖體蛋白的側(cè)流測定。

在其它另外的和/或可選擇的方面，本發(fā)明利用可結(jié)合微生物或其組分的試劑的高度特異性作為工具以檢測和分離存在于樣品中的低水平的微生物(例如，單個微生物)。例如，在某些實施方案中，該方法可包括將至少一個細菌與樣品的其它組分分離和利用多個親代噬菌體感染所述至少一個細菌的步驟。該方法還可包括裂解所述至少一個細菌以釋放存在于細菌中的子代噬菌體。該方法還可包括檢測子代噬菌體或子代噬菌體的組分，其中噬菌體或噬菌體的組分的檢測表明細菌存在于樣品中。

本發(fā)明還包括利用特異性結(jié)合劑例如噬菌體和/或抗體的特異性來從樣品分離微生物的方法和系統(tǒng)。

本文中描述的其它實施方案使用利用可檢測部分標記的子代噬菌體和/或細菌，以幫助檢測感染的細菌。例如，子代噬菌體可包括可檢測的生物分子例如螢光素酶蛋白?；蛘撸哟删w可通過包含標志生物分子例如螢光素酶蛋白的細菌的感染來定量?；蛘撸哟删w可使用與炭黑納米條形碼結(jié)合的側(cè)流測定來定量。

在其它實施方案中，本發(fā)明包括包含用于進行本文中公開的方法的組分的系統(tǒng)(例如，試劑盒)。