[發明專利]一種復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法

有效

• 申請號: 201710263110.0
• 申請日: 2017-04-21
• 公開（公告）號: CN107412851B
• 公開（公告）日: 2020-09-08
• 發明（設計）人: 胡慶夕;李帥;劉媛媛;孫程艷;沈顯虎;張毅;汪羽;連紅軍
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A61L27/12
• 分類號: A61L27/12;A61L27/20;A61L27/22;A61L27/38;A61L27/58;A61L27/50;B33Y10/00;B33Y70/10
• 代理公司: 上海上大專利事務所(普通合伙) 31205
• 代理人: 陸聰明

1.一種復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

a.配制載有人骨髓間充質干細胞的水凝膠Ⅰ作為打印骨支架的原料和載有人臍靜脈內皮細胞的水凝膠Ⅱ作為犧牲材料：將經高溫烘烤并經紫外燈消毒的水凝膠Ⅰ和水凝膠Ⅱ粉末分別倒入細胞培養液，分別配制好濃度符合宏觀打印和電流體動力學直寫條件的水凝膠Ⅰ溶液和水凝膠Ⅱ溶液；分別將培育中的第三代人骨髓間充質干細胞和第三代人臍靜脈內皮細胞從培養箱中取出，經胰蛋白酶消化，離心步驟后，倒掉上清液，分別獲得人骨髓間充質干細胞和人臍靜脈內皮細胞，各細胞分別倒入1mL新鮮配制的細胞培養液并吹打均勻，并分別倒入水凝膠Ⅰ溶液和水凝膠Ⅱ溶液，攪拌均勻，分別獲得含有人骨髓間充質干細胞的水凝膠Ⅰ溶液和含有人臍靜脈內皮細胞的水凝膠Ⅱ溶液；

b.將步驟a獲得的含有人骨髓間充質干細胞的水凝膠Ⅰ溶液倒入一支10mL醫用注射器中，供宏觀擠出打印骨支架使用，將含有人臍靜脈內皮細胞的水凝膠Ⅱ溶液倒入兩支10mL醫用注射器中，分別供擠出打印宏觀尺度犧牲模塊和電流體動力學直寫微觀尺度犧牲模塊使用；

c.將步驟b獲得的三只裝有打印材料的醫用針管分別裝載在打印平臺上，開始打印：首先接收平臺移動到宏觀擠出工位打印骨支架材料，形成骨支架基底；而后接收平臺移動到另一宏觀擠出工位打印宏觀尺度犧牲材料，形成宏觀尺度犧牲結構；最后接收平臺移動到電流體動力學直寫工位打印微觀尺度犧牲材料，形成微觀尺度犧牲結構，至此，經過三個工位的轉換完成一層同時含有骨支架材料和宏微觀尺度犧牲材料的打印；最終，三個工位在運動程序的控制下不斷轉換并復合打印成形含有宏微觀尺度犧牲結構的骨支架；

d.將步驟c中制備的含有宏微觀尺度犧牲結構的骨支架放置在含有細胞培養液、環境條件為37℃、5% CO₂的細胞培養箱中進行培養，宏微觀尺度犧牲結構隨著培養周期逐漸降解，在骨支架內部形成多尺度三維預制血管網絡；同時，宏微觀尺度犧牲結構中的內皮細胞逐漸遷移到犧牲結構表面并粘附到多尺度三維預制血管網絡形成內皮細胞層；

e．步驟d中獲得的含有多尺度三維預制血管網絡表面粘附有內皮細胞層，隨著培養周期的增加，內皮細胞相互作用，逐漸形成血管網絡；由于內皮細胞的存在，骨支架材料中的骨髓間充質干細胞逐漸分化為成骨細胞，在與內皮細胞的相互促進作用過程中，成骨細胞加速合成分泌骨基質并礦化，內皮細胞則加速血管網絡的形成，從而實現功能性大塊生物骨支架的制備，加速大塊骨缺損的修復。

2.根據權利要求1所述復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法，其特征在于，在步驟a、b中，水凝膠Ⅰ和水凝膠Ⅱ分別為明膠和海藻酸鈉。

3.根據權利要求1所述復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法，其特征在于，在步驟a、b中，水凝膠Ⅰ和水凝膠Ⅱ分別為殼聚糖和海藻酸鈉。

4.根據權利要求1或2所述復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法，其特征在于，在步驟a、b中，水凝膠Ⅰ和水凝膠Ⅱ分別為明膠和海藻酸鈉，在步驟a配制明膠溶液時，加入羥基磷灰石粉末以提高支架力學性能，且明膠粉末與羥基磷灰石粉末質量比為5：1；將經高溫烘烤并經紫外燈消毒的明膠和羥基磷灰石粉末一并倒入細胞培養液，配制好濃度適合宏觀擠出打印的明膠溶液。

5.根據權利要求1或3所述復合細胞的預血管化大塊生物骨支架構建方法，其特征在于，在步驟a、b中，水凝膠Ⅰ和水凝膠Ⅱ分別為殼聚糖和海藻酸鈉，在步驟a配制殼聚糖溶液時，加入羥基磷灰石粉末以提高支架力學性能，且殼聚糖粉末與羥基磷灰石粉末質量比為3：1；將經高溫烘烤并經紫外燈消毒的殼聚糖和羥基磷灰石粉末一并倒入細胞培養液，配制好濃度適合宏觀擠出打印的殼聚糖溶液。