[發(fā)明專利]一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體及其獲取方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710262727.0
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107217034A
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 郭子寬;張滌平;劉家權(quán);陳賢光;錢開誠;聶燕華
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市賽歐細(xì)胞生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K8/98;A61Q19/00
• 代理公司: 深圳市精英專利事務(wù)所44242
• 代理人: 任哲夫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體 及其獲取方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

MSC(Mesenchymal Stem Cell)即間充質(zhì)干細(xì)胞是干細(xì)胞的一種，因能 分化為間質(zhì)組織而得名，具有亞全能分化潛能，在特定的體內(nèi)外環(huán)境下，能 夠誘導(dǎo)分化成為多種組織細(xì)胞。間充質(zhì)干細(xì)胞具有干細(xì)胞的共性，即自我更 新、多向分化和歸巢的能力。

由于不能適應(yīng)體內(nèi)的環(huán)境，體外培養(yǎng)的人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)無論通過 何種途徑進(jìn)入體內(nèi)，如靜脈輸注、局部骨骼肌注射、腦組織注射或骨缺損組 織移植等，多數(shù)細(xì)胞在短期內(nèi)死亡。那么，死亡的細(xì)胞又是如何發(fā)揮作用的呢？近年來的研究表明，在低氧及低營養(yǎng)條件下，MSC可以釋放大量的膜微 粒(membrane microparticles，MP)。這些MP包括因細(xì)胞凋亡而形成的凋 亡小體(apoptotic bodies)，通過發(fā)芽形式釋放的膜微囊(membrane mic rovesicles，MV)，以及通過內(nèi)質(zhì)體主動釋放的外泌體(exosomes)。

三種膜微粒中，凋亡小體最大，一般直徑在1μm左右，其中富含基因組 DNA。膜微囊大小不均一，直徑在100nm至1μm之間，其表面負(fù)載著來源細(xì) 胞特征性的分子。外泌體大小均一，其直徑一般為50-200nm，其表面有內(nèi)質(zhì) 體特征性的分子，如CD9，CD63和CD81。

發(fā)明內(nèi)容

為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于克服現(xiàn)有技術(shù)在外泌體技術(shù)空白 瓶頸，從而提出一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體及其獲取方法和應(yīng)用。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明公開了一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體， 所述外泌體的外膜為磷脂雙層結(jié)構(gòu)，所述外泌體內(nèi)部含有micro-RNA、所述 外泌體源細(xì)胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一種。

本發(fā)明還公開了所述外泌體的制備方法，步驟如下：

a)對人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)階段在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干擾素、 EPO和PDGF-BB；

b)對培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理；

c)在預(yù)處理后的培養(yǎng)基的上清液中提取所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外 泌體。

優(yōu)選的，所述外泌體為MSC分化而來。

優(yōu)選的，所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

優(yōu)選的，所述預(yù)處理的具體步驟為：

1)將人傳代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞濃 度為1.0×10⁶/ml；

2)按照10⁶/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％，培養(yǎng)時 間為2-3天；

3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-MEM液體培養(yǎng)基對培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；

4)在150mm培養(yǎng)皿中再次加入20ml的alpha-MEM；

5)依次加入重組人干擾素、PDGF-BB和EPO；

6)在37℃，5％的CO₂條件下培養(yǎng)96小時，收集得到人臍帶間充質(zhì)干細(xì) 胞源培養(yǎng)液。

優(yōu)選的，所述步驟a)的步驟5)具體為：首先加入重組人干擾素、PDGF-BB， 在37℃，5％的CO₂條件下培養(yǎng)24小時；然后，再加入EPO，在37℃，5％ 的CO₂條件下培養(yǎng)72小時。

優(yōu)選的，所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源培養(yǎng)液中干擾素的濃度為10U/ml～ 600U/ml、PDGF-BB的濃度為2ng/ml～60ng/ml，EPO的濃度為0.1IU/ml～ 5IU/ml。

優(yōu)選的，所述步驟b)的具體為：

1)取所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源培養(yǎng)液的上清液，進(jìn)行離心處理，去除 細(xì)胞碎片；

2)然后將上清液濾膜過濾處理，去除凋亡小體，得到預(yù)處理后的上清液。

優(yōu)選的，所述步驟c)具體為：

1)取容積為5體積份的離心管，加入1體積份的外泌體分離試劑；

2)加入4體積份的經(jīng)過預(yù)處理后的上清液，充分混勻；

3)靜置處理后，再進(jìn)行兩次離心處理，得到所述外泌體。

優(yōu)選的，所述外泌體在美容制劑的制備領(lǐng)域中的應(yīng)用。

優(yōu)選的，任一項(xiàng)所述獲取方法在制備外泌體美容制劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明所得外泌體 可以進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和管網(wǎng)結(jié)構(gòu)形成，可以作為護(hù) 膚美容制品的活性成分，具有極大的市場前景和應(yīng)用價值。

附圖說明