[發(fā)明專利]一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干保存方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201710262116.6
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107006452A
• 公開（公告）日: 2017-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 葛四海;劉家權(quán);郭子寬;陳賢光;錢開誠;劉瑤
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市賽歐細(xì)胞生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/00
• 分類號: A01N1/00;C12N5/0775;A61L27/36
• 代理公司: 深圳市精英專利事務(wù)所44242
• 代理人: 任哲夫

1.一種人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體的凍干保存方法，其特征在于，

取所得100重量份的外泌體，加入1～15重量份的甘露醇，0.1-1重量份的絲膠蛋白，混勻，過濾，再放置于-50～-80℃的溫度下保存；然后進(jìn)行凍干處理，得到人間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體凍干粉。

2.如權(quán)利要求1所述的凍干保存方法，其特征在于，所述凍干處理的溫度為-50℃，凍干時(shí)間為24h，壓強(qiáng)為10Pa。

3.如權(quán)利要求2所述的凍干保存方法，其特征在于，所述外泌體的外膜為磷脂雙層結(jié)構(gòu)，所述外泌體內(nèi)部含有micro-RNA、所述外泌體源細(xì)胞的mRNA、DNA和核酸中的至少一種。

4.如權(quán)利要求3所述的凍干保存方法，其特征在于，所述外泌體為MSC分化得到的；所述間充質(zhì)干細(xì)胞為人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞。

5.如權(quán)利要求4所述的凍干保存方法，其特征在于，所述外泌體的獲取方法步驟如下：

a)對人間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)階段在細(xì)胞培養(yǎng)基中添加干擾素、EPO和PDGF-BB；

b)對培養(yǎng)后的干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理；

c)在預(yù)處理后的培養(yǎng)基的上清液中提取所述人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞源外泌體。

6.如權(quán)利要求5所述的凍干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述所述預(yù)處理的具體步驟為：

1)將人傳代MSC進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)，并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×10⁶/ml；

2)按照10⁶/150mm大培養(yǎng)皿接種，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度至70-80％，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天；

3)吸除培養(yǎng)皿中的液體，并用alpha-MEM液體培養(yǎng)基對培養(yǎng)皿進(jìn)行洗滌；

4)在150mm培養(yǎng)皿中再次加入20ml的alpha-MEM；

5)依次加入重組人干擾素、PDGF-BB和EPO；

7)在37℃，5％的CO₂條件下培養(yǎng)96小時(shí)，收集得到MSC培養(yǎng)液。

7.如權(quán)利要求6所述的凍干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述MSC培養(yǎng)液中干擾素的濃度為10U/ml～600U/ml、PDGF-BB的濃度為2ng/ml～60ng/ml，EPO的濃度為0.1IU/ml～5IU/ml。

8.如權(quán)利要求7所述的凍干保存方法，其特征在于，其特征在于，所述步驟2)的預(yù)處理的具體為：

1)取所述MSC培養(yǎng)液的上清液，進(jìn)行離心處理，去除細(xì)胞碎片；

2)然后將上清液濾膜過濾處理，去除凋亡小體，得到預(yù)處理后的上清液。

9.如權(quán)利要求8所述的外泌體的獲取方法，其特征在于，所述步驟3)具體為：

1)取容積為5體積份的離心管，加入1體積份的外泌體分離試劑；

2)加入4體積份的經(jīng)過預(yù)處理后的上清液，充分混勻；

3)靜置處理后，再進(jìn)行兩次離心處理，得到所述外泌體。

10.如權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述凍干保存方法在美容制劑的制備領(lǐng)域中的應(yīng)用。