[發明專利]檢測豬藍耳病毒經典毒株、高致病性變異毒株和NADC?30毒株的RT?PCR方法

在審

• 申請號: 201710261905.8
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN106868224A
• 公開（公告）日: 2017-06-20
• 發明（設計）人: 張斌;岳華;湯承;王遠微;覃思楠
• 申請（專利權）人: 西南民族大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙)11350
• 代理人: 湯東鳳

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，具體地說，涉及一種檢測豬藍耳病毒經典毒株、高致病性變異毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法。

背景技術

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)又稱為豬藍耳病，以引起母豬流產，產死胎、弱胎、木乃伊胎以及仔豬和育肥豬呼吸困難、敗血癥、高死亡率為主要特征。該病在世界各地普遍存在，給我國的養豬業造成嚴重的經濟損失。近年來，PRRSV的變異現象引起了人們的關注，國外的研究表明，同一基因型的分離毒株之間存在明顯的序列差異，PRRSV的變異是造成本病難以控制的重要原因之一。

目前國際上根據PRRSV的抗原特性，可將其分為歐洲型和美洲型2個血清型，美洲型毒株又根據其在非結構蛋白NSP2堿基數的缺失分為三種亞型，分別為經典毒株、高致病性變異毒株和NADC-30毒株。

RT-PCR方法具體操作步驟是先用特異性引物擴增樣品核酸的特異片段基因，取PCR產物跑瓊脂糖凝膠電泳，然后在凝膠成像儀拍照觀察，依據目的基因片段大小判斷是否為NADC-30目標片段，如基因片段大小為493bp，判定為豬藍耳病毒陽性，如基因片段大小為860bp，則判定為高致病性豬藍耳病毒陽性，如果基因片段大小為757bp，則判定為豬藍耳病毒類NADC-30毒株陽性，否則判定為陰性。RT-PCR方法特異性和靈敏度高。

目前現有技術中沒有一種同時檢測豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(PRRSV)三種亞型(經典毒株、高致病性變異毒株、NADC-30毒株)的RT-PCR方法。采用單一對引物分別用PCR擴增三種亞型存在操作復雜、檢測時間長等缺點，不能及時了解檢測樣本PRRS的基因特點。

發明內容

有鑒于此，本發明針對采用單一對引物分別用PCR擴增三種亞型存在操作復雜、檢測時間長的問題，提供了一種檢測豬藍耳病毒經典毒株、高致病性變異毒株、NADC-30毒株的RT-PCR方法，可以對疑似患有豬藍耳病毒的臨床樣本進行檢測，從而用于豬藍耳病毒的診斷及流行病學監測。目前三種不同亞型的藍耳病病毒在豬群中普遍存在，但未有同時檢測三種亞型的藍耳病病毒的檢測方法。本發明在多株PRRSV Nsp2基因序列比對基礎上，設計了一對可區分經典毒株、高致病性毒株和NADC30毒株三種不同基因型PRRSV的特異性引物，本發明是一種簡單、快速、靈敏度高和特異強的檢測方法。

為了解決上述技術問題，本發明公開了一種檢測豬藍耳病毒經典毒株、變異株和NADC-30樣毒株的引物，用于RT-PCR反應，該引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。

本發明還提供一種檢測豬藍耳病毒經典毒株、高致病性變異毒株和NADC-30毒株的RT-PCR方法，包括以下步驟：以待檢測樣品的RNA為模板，反轉錄得到cDNA，用上述的引物，對待測樣本進行RT-PCR擴增，用1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物；擴增產物大小為887bp，則樣本中含有或候選含有豬藍耳病毒經典毒株；擴增產物大小為797bp，則樣本中含有或候選含有高致病性變異毒株；擴增產物大小為493bp，則樣本中含有或候選含有NADC-30毒株。

進一步地，用購自寶生物工程(大連)有限公司的反轉錄試劑盒進行反轉錄，所述反轉錄的步驟為：將RNA模板4μL與1號5×Prime Script Buffer 4μL、2號Prime ScriptRT Enzyme Mix 1μL、4號Random 6mers 2μL和5號RNase Free dH₂O 9μL混勻，放入PCR儀上進行反轉錄。

進一步地，反轉錄的反應條件為：37℃15min，85℃15s，16℃10min。

進一步地，所述RT-PCR擴增的反應體系如下：模板cDNA 3μL，Quick Taq HS DyeMix 10μL，上游引物和下游引物各0.6μL，余下的由ddH₂O補足，總量為20μL。

進一步地，RT-PCR擴增的反應體系條件如下：94℃預變性2min；94℃變性30s，55℃退火30s，68℃延伸1min，共35個循環；72℃延伸8min。

與現有技術相比，本發明可以獲得包括以下技術效果：

1)本發明建立的方法對200份疑似患有PRRSV的核酸樣本進行RT-PCR檢測，檢出率為46.5％(93/200)，其中經典毒株檢測率為8.5％(17/200)、高致病性變異毒株檢出率為28.5％(57/200)和NADC-30毒株檢出率為9.5％(19/200)。