[發明專利]一種腫瘤組織的保存方法及保存試劑

在審

• 申請號: 201710261155.4
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107041361A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 盧戌;梁孟儒;王燕飛;劉雪松;劉靜維;王躍;黃彩庭;李京坡;吳璇
• 申請（專利權）人: 北京奧康華醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,張立娜

技術領域

本發明屬于生物醫學領域，涉及一種腫瘤組織的保存方法及保存試劑。

背景技術

隨著腫瘤對人類的影響和危害性的增加，如何保護、保存并充分利用人類腫瘤遺傳資源，提高我國腫瘤防治水平，已經成為當務之急。作為腫瘤研究材料的活腫瘤組織標本在促進腫瘤研究進展過程中扮演了重要角色，具有重要的科研和臨床應用價值，而活腫瘤組織保存技術成為實現這些價值的基礎。

目前活腫瘤組織保存的方式一般為直接冷凍保存，所需冷凍保護劑多采用DMSO、血清和細胞培養液組成，需要現用現配，且這種組織凍存液的穩定性較差，使得其保質期較短，保存條件也較為苛刻。

使用現有的冷凍保存方法在凍存及解凍后無法保證腫瘤組織的結構完整性，且極易丟失腫瘤自身的遺傳特性，降低了組織標本的臨床研究價值。

目前急需一種更加長效且更加便捷的腫瘤組織保存方法。

發明內容

本發明的目的是提供一種腫瘤組織的保存方法及保存試劑。

本發明所提供的腫瘤組織保存方法，具體可包括如下步驟：

(1)將待保存的腫瘤組織置于腫瘤組織酶解試劑中，于20-25℃培養10-20min(如15min)，得到酶解后腫瘤組織；

所述腫瘤組織酶解試劑中含有透明質酸酶和DNA酶Ⅰ；每升所述腫瘤組織酶解試劑中含有40-150U的所述透明質酸酶，含有高于40Kunitz U的所述DNA酶Ⅰ。

其中，所述透明質酸酶的酶活定義同sigma公司貨號為H3506的透明質酸酶的酶活定義。所述DNA酶Ⅰ的酶活定義同sigma公司貨號為DN25-1G的DNA酶Ⅰ的酶活定義。

在本發明中，所述透明質酸酶具體為sigma公司產品，貨號為H3506。所述DNA酶Ⅰ具體為sigma公司產品，貨號為DN25-1G。相應的，所述透明質酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-150mg/mL；所述DNA酶Ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度可為100-120mg/mL。

(2)將所述酶解后腫瘤組織置于冷凍保存液中，在4℃預平衡10-20min(如15min)，得到預平衡后腫瘤組織；

(3)將所述預平衡后腫瘤組織進行程序化冷凍，待溫度降至-150℃后，轉入液氮罐中進行儲存。

鑒于多數實體腫瘤組織含有大量的膠原結締組織，使其本身具備結構致密的特性，因而本發明通過既定的腫瘤組織酶解試劑對其進行室溫培養的操作，實現了腫瘤組織酶解試劑對膠原等組織進行酶解的效果，使致密的實體腫瘤組織間質疏松，進而利于后續預平衡過程中冷凍保存液的順利滲透；進而縮短了后續在冷凍保存液中的平衡時間。通過酶解處理之后，在預平衡的過程中，僅用10-20分鐘即可達到預平衡效果(冷凍保存液滲透到腫瘤組織中心)；與現有技術中常見的30-90分鐘的預平衡時間相比，大幅縮短了預平衡的時間，避免了由于預平衡時間過長，進而導致其冷凍保護劑對腫瘤組織的細胞毒性損傷。

在所述方法中，所述腫瘤組織酶解試劑由所述透明質酸酶、所述DNA酶Ⅰ和含體積百分含量為10％胎牛血清的DMEM培養液組成。

更加具體的，每升所述腫瘤組織酶解試劑中含有48-120U的所述透明質酸酶，含有高于40Kunitz U的所述DNA酶Ⅰ，余量為含體積百分含量為10％胎牛血清的DMEM培養液。其中，所述透明質酸酶的酶活定義同sigma公司貨號為H3506的透明質酸酶的酶活定義。所述DNA酶Ⅰ的酶活定義同sigma公司貨號為DN25-1G的DNA酶Ⅰ的酶活定義。在本發明中，所述透明質酸酶具體為sigma公司產品，貨號為H3506。所述DNA酶Ⅰ具體為sigma公司產品，貨號為DN25-1G。相應的，所述透明質酸酶在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度具體為120mg/mL；所述DNA酶Ⅰ在所述腫瘤組織酶解試劑中的濃度具體為100mg/mL。

所述冷凍保存液由DMSO與蔗糖組成；在所述冷凍保存液中，DMSO與蔗糖的濃度分別為1mol/L和0.1mol/L。

步驟(1)中，在將所述待保存的腫瘤組織置于所述腫瘤組織酶解試劑中之前，還可包括如下步驟：收集腫瘤組織，置于含體積百分含量為10％胎牛血清的DMEM培養液中，在5-10min內用冰盒運送至生物安全柜內，更換新鮮的含體積百分含量為10％胎牛血清的DMEM培養液，并將腫瘤組織剪切成(0.5mm-1.5mm)×(0.8mm-1.2mm)×(2.5mm-3.5mm)大小，得到所述待保存的腫瘤組織。