[發明專利]一種檢測豬瘟病毒的重組酶常溫擴增核酸（RT?RPA）試紙條試劑盒及應用

在審

• 申請號: 201710260638.2
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107435080A
• 公開（公告）日: 2017-12-05
• 發明（設計）人: 陳金頂;張靜遠;范雙旗;徐海孌;劉志香;趙明秋;李軍
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所44329
• 代理人: 楊曉松

技術領域

本發明涉及一種檢測豬瘟病毒的試劑盒及其用途，特別涉及一種基于RPA 反應的用于快速檢測豬瘟病毒的試紙條RPA試劑盒，還涉及在快速檢測豬瘟病 毒中的用途，本發明屬于預防獸醫學檢驗領域。

背景技術

豬瘟(Classical swine fever，CSF)是危害養殖業發展的一種豬的重大 烈性傳染病，主要由豬瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)感染引 起發病，以出血、高熱、免疫抑制和淋巴細胞減少為主要特征,是世界衛生組織 (OIE)所列的疫病目錄必須通報的傳染病之一。豬感染CSFV后，根據其毒株毒 力的不同以及被感染的豬年齡、品種的不同，疾病可以表現為溫和或是嚴重等 多種形式，其主要引起大量的白細胞減少和免疫抑制，造成廣泛的出血點和上 皮損傷，表現為器官嚴重的淤血、出血。豬瘟病毒還可造成垂直感染的發生， 妊娠母豬感染后會出現“帶毒母豬綜合征”，發生流產、弱胎、死胎、木乃伊胎， 新生仔豬死亡等，其次耐過的豬會終身帶毒。

豬瘟的歷史悠久，1833年首先出現于美國的俄亥俄洲，之后傳播到世界各 大洲。目前仍廣泛分布于歐洲、亞洲、南美洲的大部分養豬國家。該病一年四 季都可發生且發病的時間多于春夏多雨季節。雖然我國所研制出兔化弱毒疫苗， 能有效控制豬瘟在我國大規模的爆發流行，但近50年來，我國的大部分地區 豬瘟仍廣泛存在，呈現散發流行，發病年齡偏小，發病表現溫和，垂直傳播嚴 重，持續感染與隱性感染共存，免疫耐受以及混合感染嚴重病情復雜等發病特 點，嚴重損害我國養豬業的發展，對畜產品造成巨大的損失。

目前用于豬瘟病毒的檢測方法主要包括病原的分離鑒定，血清學方法、分 子生物學方法。病原學方法是最傳統的檢測方法，其特異性強，結果真實可靠， 但是實際操作時費時費力且敏感性低，因此在臨床應用過程中有一定的局限性。 ELISA、中和試驗、血凝抑制試驗等血清學方法特異性差無法確診，而RT-PCR、 熒光定量PCR等分子生物學方法需要昂貴的儀器設備且需要專業技術人員進行 操作，難以滿足非實驗室等基層現場環境下的檢測要求。

重組酶聚合酶等溫擴增技術(Recombinase Ploymerase Amplication)是在 重組酶聚合酶的介導下模擬生物體內DNA復制的過程，被稱為可以替代PCR的 核酸檢測技術。其擴增原理是，重組酶與引物結合形成復合物后，尋找匹配的 DNA同源序列，緊密結合發生重組，在單鏈DNA結合蛋白的作用下，模板DNA 開始解鏈，引物與模板DNA配對，在bsu DNA聚合酶的作用下復制延伸，對目 的片段進行指數級擴增(Forget et al.,2012)。RPA與PCR不同，整個過程僅需 要在37-42℃等溫條件下反應15-20分鐘即可得到擴增產物，不需要高溫變性和 退火的過程，整個反應簡單、快速、高效。對于RPA與側向流動免疫層析技術 相結合(Recombinase Ploymerase Amplication-lateral flow dipstick,RPA-LFD),可以在水浴鍋或者直接用人體溫進行加熱，將溫度控制在 37-42℃之間，隨后可直接通過側向流動層析試紙條讀取實驗結果。在整個反應 體系中，需要生物素標記的反向引物和羧基熒光素(FAM)標記的特異探針，該探 針在距羧基熒光集團30個堿基處有一個脫堿基位點(dSpacer),該位點可被大 腸桿菌核酸外切酶nof進行識別并切割，產生自由的羥基末端，然后便在DNA 聚合酶的作用下延伸，形成具有生物素和羧基熒光集團雙標記的RPA產物。將 其滴加于試紙條上便會與膠體金標記的抗FAM的抗體結合，形成三元復合物， 通過層析膜擴散，被生物素配體捕獲，形成具有顏色的檢測線。此方法直觀高 效，3-5分鐘內就可通過肉眼判讀。

本發明針對豬瘟病毒的NS5B基因，建立并評估了基于RT-RPA核酸試紙條 檢測試劑盒。與常規PCR引物不同，RPA所需的引物長度為30-35bp，探針序列 的長度為46-52bp,引物設計時為了避免形成引物內部及之間的二級結構，其長 度的增加也使引物設計及選擇難度的增加，因此，引物的設計和選擇對RPA的 結果至關重要。RPA技術正處于起步研究階段，尚無專門的引物、探針設計軟件， 也沒有大量的數據為其引物設計原則提供依據。

發明內容

針對RT-RPA-測流層析技術應用于CSFV檢測領域的空白，本發明提供了一 種RT-RPA-LFD檢測豬瘟病毒的引物、探針以及試劑盒，該試劑盒具有高靈敏度、 高特異性、可視化、操作方法簡單等優點。