[發明專利]基于ARMS?PCR檢測人MTHFR基因多態性的方法、引物及試劑盒

在審

• 申請號: 201710259900.1
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107841548A
• 公開（公告）日: 2018-03-27
• 發明（設計）人: 徐祎春;周佳菁;袁箐;韓峻松
• 申請（專利權）人: 上海生物芯片有限公司
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海浦一知識產權代理有限公司31211
• 代理人: 陸紅杰

1.人MTHFR基因SNP檢測引物組，用于檢測人MTHFR基因上rs1801133號和rs1801131號SNP位點的基因型，其特征在于，包括用于檢測所述rs1801133號SNP位點的C/C基因型的引物對、用于檢測所述rs1801133號SNP位點的T/T基因型的引物對、用于檢測所述rs1801131號SNP位點的A/A基因型的引物對、用于檢測所述rs1801131號SNP位點的C/C基因型的引物對；其中，

所述用于檢測rs1801133號SNP位點的C/C基因型的引物對具有與SEQ ID NO:1所示序列80％以上相同的上游序列和與SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的下游序列；

所述用于檢測rs1801133號SNP位點的T/T基因型的引物對具有與SEQ ID NO:2所示序列80％以上相同的上游序列和與SEQ ID NO:3所示序列80％以上相同的下游序列；

所述用于檢測rs1801131號SNP位點的A/A基因型的引物對具有與SEQ ID NO:4所示序列80％以上相同的上游序列和與SEQ ID NO:6所示序列80％以上相同的下游序列；

所述用于檢測rs1801131號SNP位點的C/C基因型的引物對具有與SEQ ID NO:5所示序列80％以上相同的上游序列和與SEQ ID NO:6所示序列80％以上相同的下游序列。

2.根據權利要求1所述的引物組，其特征在于，所述用于檢測rs1801133號SNP位點的C/C基因型的引物對的上游序列如SEQ ID NO:1所示，下游序列如SEQ ID NO:3所示；所述用于檢測rs1801133號SNP位點的T/T基因型的引物對的上游序列如SEQ ID NO:2所示，下游序列如SEQ ID NO:3所示；所述用于檢測rs1801131號SNP位點的A/A基因型的引物對的上游序列如SEQ ID NO:4所示，下游序列如SEQ ID NO:6所示；所述用于檢測rs1801131號SNP位點的C/C基因型的引物對的上游序列如SEQ ID NO:5所示，下游序列如SEQ ID NO:6所示。

3.根據權利要求1或2所述的引物組，其特征在于，所述上游序列的3’端的最后一個堿基標記有鎖核酸修飾。

4.基于ARMS-PCR檢測人MTHFR基因多態性的PCR反應試劑盒，其特征在于，包含有權利要求1-3任一項所述的引物組。

5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包含有人MTHFR基因上rs1801133號SNP位點C/C型質粒的標準品、rs1801133號SNP位點T/T型質粒的標準品、rs1801131號SNP位點A/A型質粒的標準品、rs1801131號SNP位點C/C型質粒的標準品。

6.基于ARMS-PCR檢測人MTHFR基因多態性的方法，其特征在于，步驟包括：

1)提取樣本DNA并純化；

2)以步驟1)所得DNA為模板，在編號為A、B、C、D的四個PCR反應管內，同時進行實時熒光定量PCR擴增反應；其中：

A管內加入權利要求1-3任一項所述的用于檢測所述rs1801133號SNP位點的C/C基因型的引物對；

B管內加入權利要求1-3任一項所述的用于檢測所述rs1801133號SNP位點的T/T基因型的引物對；

C管內加入權利要求1-3任一項所述的用于檢測所述rs1801131號SNP位點的A/A基因型的引物對；

D管內加入權利要求1-3任一項所述的用于檢測所述rs1801131號SNP位點的C/C基因型的引物對；

3)根據Ct值判斷樣本MTHFR基因的rs1801133號和rs1801131號兩個SNP位點的基因型。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)，PCR反應條件為92～97℃預變性0.5～10min；92～97℃變性10～30s，56～60℃退火10～60s，40～50個循環。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，步驟3)，基因型的判斷方法為：Ct值≥36時，判為不表達；Ct值＜36，判為表達；當A管中表達，B管中不表達時，判斷rs1801133的基因型為C/C型；當A管中表達，B管中同時表達時，判斷rs1801133的基因型為T/C型；當A管中不表達，B管中表達時，判斷rs1801133的基因型為T/T型；當C管中表達，D管中不表達時，判斷rs1801131的基因型為A/A型；當C管中表達，D管中同時表達時，判斷rs1801131的基因型為A/C型；當C管中不表達，D管中表達時，判斷rs1801131的基因型為C/C型。