[發明專利]一種桔霉素親和蛋白的制備方法

有效

• 申請號: 201710259437.0
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107011437B
• 公開（公告）日: 2020-06-23
• 發明（設計）人: 王向陽;顧雙;陳俊霖;楊玲;王芳;江一菲
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C07K16/14
• 分類號: C07K16/14
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

1.一種桔霉素親和蛋白的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

取經桔霉素免疫的牛蛙的血清20mL至容器中，再加入20mL的0.01M、pH7.4的磷酸緩沖液；將容器置于冰上，用玻璃棒攪拌混勻；在攪拌同時滴加飽和硫酸銨溶液40mL，使混合物中硫酸銨的最終質量濃度為50％；在4℃冰箱中靜置3h后，在8000r/min和4℃條件下離心30min，棄上清液；

沉淀用20mL的0.01M、pH 7.4的磷酸緩沖液溶解后，在攪拌同時滴加飽和硫酸銨溶液13.33mL，使混合物中硫酸銨的最終質量濃度為40％；在4℃冰箱中靜置1h后，在8000r/min和4℃條件下離心30min，棄上清液；

沉淀用20mL的0.01M、pH 7.4的磷酸緩沖液溶解后，在攪拌同時滴加飽和硫酸銨溶液9.85mL，使混合物中硫酸銨的最終質量濃度為33％；在4℃冰箱中靜置1h后，在8000r/min和4℃條件下離心30min，留上清液，去沉淀；

取10mL上清液，加入200mL的0.01M、pH7.4的磷酸緩沖液作為透析液，在4℃冰箱中透析脫鹽3h；取透析袋中的蛋白質冷凍干燥，收集粉末即為桔霉素親和蛋白，在-20℃儲藏備用；

所述經桔霉素免疫的牛蛙的血清是通過下述方式獲得的：

(1)制備紅曲培養液：使用從紅曲粉中分離得到的安卡紅曲霉，接種到MSG液態培養基中培養；每瓶取50mL MSG培養基，接種20μL菌體安卡紅曲霉，瓶口紗布球隔離；在(30±1)℃下培養5d，使桔霉素的含量達到40.4μg/mL；

(2)取市售牛蛙養于水桶，每桶3.8-4.2kg牛蛙，水與牛蛙重量比值為1:1；添加1mL桔霉素含量為40.4μg/mL的紅曲培養液，常溫養殖；

(3)在免疫后的8d-24d內，取剛死亡牛蛙并在15min內采血，在1h內以3000r/min的速度離心處理15min，收集上清液，即為經桔霉素免疫的牛蛙的血清。

2.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述飽和硫酸銨溶液的配制方法為：稱取硫酸銨450g，溶于500mL純水中，加熱至溶質不能溶解為止，趁熱過濾；濾液在室溫下過夜后，用28％氨水調節pH至7.0。

3.根據權利要求1的方法，其特征在于，所述磷酸緩沖液配制方法為：

稱取2.9g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.27g的K₂HPO₄、0.2g的KCl、8.0g的NaCl，加超純水溶解，定容至1000mL，再加熱煮沸，冷卻待用。