[發明專利]利用熒光顯微鏡觀察桔霉素免疫后牛蛙抗體和親和的方法

有效

• 申請號: 201710259433.2
• 申請日: 2017-04-20
• 公開（公告）號: CN107219201B
• 公開（公告）日: 2019-11-12
• 發明（設計）人: 王向陽;楊玲;顧雙
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 周世駿

本發明涉及食品安全檢測技術，旨在提供一種利用熒光顯微鏡觀察桔霉素免疫的親和蛋白的方法。包括：取來自桔霉素抗體免疫組牛蛙和對照組牛蛙的蛋白提取液，各加入桔霉素標準品，混勻后在冰箱中靜置；然后分別裝入透析袋進行透析；取透析袋內的保留液滴在載玻片中央置于熒光顯微鏡中；使用藍綠光激發濾板，分析熒光斑點的大小。本發明以熒光顯微鏡技術觀察桔霉素免疫后的牛蛙血清蛋白和肌肉蛋白的形態，并通過測定熒光斑點面積來鑒定桔霉素結合蛋白。相對于傳統的鑒定方法具有快速、準確、直接的特點，對牛蛙抗體和肌肉親和蛋白的形態觀察、桔霉素結合蛋白的快速篩選具有重要的實際意義。

技術領域

本發明依據熒光物質和特異親和蛋白質之間的吸附原理，利用熒光顯微鏡觀察桔霉素免疫后牛蛙親和蛋白，屬于食品安全檢測技術。

背景技術

桔霉素(Citrinin)是一種真菌毒素。桔霉素的分子結構為共軛的平面結構，具有天然的熒光特性。兔子、大鼠、小鼠是常見的制備桔霉素的免疫抗體的動物。為了鑒定抗體蛋白質是否與桔霉素結合，有人利用熒光分光光度計分別對抗體的桔霉素溶液和桔霉素標準溶液進行熒光掃描，通過比較熒光光譜中熒光強度最大發射峰所對應的波長的變化，以此判定抗體是否與桔霉素共價結合。其原理是物質分子上連接的取代基結構對化合物的光學性能會產生較大的影響，使化合物熒光光譜最大發射峰所對應的波長發生變化。這種方法可以判斷兩者結合能力，但是這種方法無法觀察到牛蛙中桔霉素親和蛋白的形態。目前對于兩棲綱動物免疫球蛋白分子的研究主要是以對非洲爪蟾的研究為主。它具有IgM、lgX、IgY和IgD、IgF五類。IgM是爪蟾生活史中最早產生的、最重要的免疫球蛋白。IgX在結構上與IgM類似，以聚合體的形式存在，在功能上類似于哺乳動物的IgA，主要在腸道中表達，在血清中含量很低。IgY在爪蟾生活史中出現較晚。IgD和IgF是最新發現的兩種免疫球蛋白分子，IgD僅在脾臟中有微弱表達，結構與其他動物IgD相同；IgF基因組與其他免疫球蛋白分子不同，其重鏈基因僅具有兩個結構，其功能還未有研究。通過電泳分析，蛙類抗體存在兩類，分別為低分子量7S和高分子量18S，已有研究證明，蛙類18S抗體類似于人IgM，而關于7S抗體的功能還沒有統一的定論。兩棲類動物的抗體與哺乳動物的抗體有很大差別，其抗體至今尚未完全清楚。牛蛙抗體更是沒有報道。另外醫學上存在超敏現象，一般認為是因為某種小分子的半抗原，與體內組織蛋白結合，在體內形成完全抗原，從而誘導抗體的產生。但是一直沒有具體哪種組織蛋白的報道，也缺少組織蛋白與半抗原結合的證據。本方法提供了一種直接觀察牛蛙抗體蛋白和組織蛋白的方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種利用熒光顯微鏡觀察桔霉素免疫的牛蛙親和蛋白的方法，用于觀察親和蛋白是否與桔霉素結合、結合程度，以及親和蛋白的形態。

為解決技術問題，本發明的解決方案是：

提供一種利用熒光顯微鏡觀察桔霉素免疫的親和蛋白的方法，其包括以下步驟：

(1)取來自桔霉素抗體免疫組牛蛙和對照組牛蛙的蛋白提取液各1mL，提取液中的蛋白含量為2.4～3.6mg/mL；向提取液中各加入1mL濃度為1.5μg/mL的桔霉素標準品，混勻后在4℃冰箱中靜置3h；然后分別裝入透析袋，并各加入20mL的0.01M、pH7.4的PBS作為透析液，在4℃冰箱透析13h；

(2)各取10μL透析袋內的保留液，滴在載玻片中央并蓋上蓋玻片，置于光顯微鏡中；使用藍綠光激發濾板490-520nm，顯微鏡放大倍數為40×10倍，比例尺為100μm；使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析熒光斑點的大小；