[發(fā)明專利]一種母血漿游離DNA文庫的構(gòu)建方法以及父源等位基因的分型方法

有效

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• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107119046B
• 公開（公告）日: 2020-04-21
• 發(fā)明（設計）人: 歐雪玲;楊冬桂;梁灝
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C40B50/06;C12Q1/6806;C12Q1/6869;C12Q1/6876
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

本發(fā)明公開了一種母血漿游離DNA文庫的構(gòu)建方法以及父源等位基因的分析方法。首先設計了一組擴增母血漿游離DNA中SNP的特異性引物組，包括720對引物，上下游引物序列依次如SEQ ID NO.1～1440所示。然后采集9?20周孕婦外周血用于血漿游離DNA提取，并應用多重復合PCR擴增技術對進行游離DNA的文庫構(gòu)建；文庫經(jīng)純化、定量后，在Ion Torrent^TM平臺上機測序。使用同樣的方法對相應的母血細胞和胎兒組織基因組DNA進行文庫制備和測序。根據(jù)測序結(jié)果，選擇母血細胞為純合子的SNP位點，分析母血漿中游離DNA在相應位點上非母等位基因的百分比濃度，達到確定游離DNA中父源等位基因的目的。

技術領域

本發(fā)明屬于生物學技術領域。更具體地，涉及一種母血漿游離DNA文庫構(gòu)建方法和父源等位基因的分型方法，包括設計母血漿游離DNA的文庫構(gòu)建和高通量測序方法和試劑，以及游離DNA中父源等位基因的確定方法。

背景技術

以往產(chǎn)前的胎兒遺傳診斷主要基于有創(chuàng)取樣，包括絨毛膜絨毛取樣(chorionicvillus sampling，CVS)和羊水穿刺(amniocentesis)，這些診斷方法雖然準確率高，但其操作有創(chuàng)傷性，可導致宮內(nèi)感染、流產(chǎn)和死胎等多種妊娠不良反應，且其取樣時間均不可早于10周。1997年在孕婦血漿中游離胎兒DNA(fetal cell-free DNA，cff DNA)的發(fā)現(xiàn)，使無創(chuàng)產(chǎn)前檢測成為可能，對避免有創(chuàng)取樣帶來的風險，有效保障母胎健康有重要的意義。進一步研究表明，cffDNA片段能夠攜帶胎兒整個染色體組的遺傳信息，從懷孕第4周開始在孕婦血漿中出現(xiàn)，孕7周后cffDNA可以一定的比例穩(wěn)定地存在于母體外周血中，其含量隨著孕齡的增加逐漸增高，直至分娩前迅速增加，并能夠在胎兒娩出后48小時內(nèi)迅速從產(chǎn)婦體內(nèi)代謝排出，不受既往妊娠的干擾。因此，孕婦血漿中的cffDNA被認為是目前最理想的無創(chuàng)性胎兒檢材。目前，cffDNA在胎兒性別診斷、單基因遺傳性疾病、胎兒三體綜合征等多種臨床產(chǎn)前診斷中有廣泛的應用。

在法醫(yī)遺傳學研究中，研究者一直致力于利用孕婦血漿cffDNA進行遺傳標記的檢測和父源等位基因的分析，以實現(xiàn)無創(chuàng)父權鑒定。基于一代毛細管電泳(CE)的STR分型系統(tǒng)是目前在法醫(yī)遺傳學研究中應用最廣泛、最成熟的方法技術。然而，cffDNA濃度在母血漿總游離DNA(Cell-free DNA，cfDNA)中含量較低，一般認為小于20％，在孕早期中一般小于5％，且呈高度片段化，其大小主要集中在150～200bp范圍；而常規(guī)的STR擴增子長度在100～350bp范圍內(nèi)且大小不均一，導致大片段父源STR等位基因得不到有效擴增而被強大的母體DNA背景掩蓋此外，STR分型中容易出現(xiàn)的影子帶(stutter band)等非特異產(chǎn)物，增加分析的難度，影響分型的準確性。

與STR相比，單個SNP位點因其分布廣泛、突變率低、擴增片段短等特點使其具有較好的法醫(yī)學應用前景，被認為是第三代DNA遺傳標記。隨著SNP數(shù)據(jù)庫的不斷完善以及相關檢測技術的長足發(fā)展，越來越多的研究者開始采用SNP分型技術對母血漿游離DNA進行法醫(yī)遺傳學分析。按照SNP分型通量的大小可以分為：低通量的SNP分型方法有Sanger測序法，等位基因特異性雜交電泳法等；中通量的SNP分型方法有質(zhì)譜法、SnaPshot法、高分辨溶解曲線分析法；高通量的SNP分型方法包括SNP基因芯片分型和基于新一代測序(Nextgeneration sequecing，NGS)平臺的SNP分型。目前，越來越多的研究使用NGS技術對母血漿游離DNA進行目標SNP區(qū)域的父源等位基因檢測和分析。

基于NGS技術的游離DNA檢測其關鍵環(huán)節(jié)在于測序文庫的構(gòu)建。但是，現(xiàn)階段主要采用芯片雜交捕獲法(on-array hybrid-capture)進行高通量測序的文庫制備，此法需要的模板DNA量較大，且需定制大量的區(qū)域特異性探針，通過雜交技術捕獲目標SNP區(qū)域，成本高，實驗周期長，技術流程繁瑣，因此在大樣本分析、技術轉(zhuǎn)化和推廣應用等方面均面臨著巨大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容