[發明專利]一種用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應的改良蛋白dMete1及其制備方法及應用

在審

• 申請號: 201710255979.0
• 申請日: 2017-04-18
• 公開（公告）號: CN106916215A
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 王彥波;傅玲琳;饒志恒;周瑾茹
• 申請（專利權）人: 浙江工商大學
• 主分類號: C07K14/435
• 分類號: C07K14/435;C12N15/70;A23L33/18;A61K38/17;A61P37/08
• 代理公司: 杭州天勤知識產權代理有限公司33224
• 代理人: 黃平英

技術領域

本發明涉及水產食品過敏免疫調控領域，介紹了一種以新對蝦屬(Metapenaeus)原肌球蛋白(Met e 1)為原型，通過針對性的比對，設計制備的一種可用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應的改良蛋白dMet e 1制備方法，旨在為典型水產食品過敏的控制提供支撐。

背景技術

食物過敏是一類典型的過敏反應，是一種由IgE介導的速發性免疫反應，成為近年來關注的熱點。對蝦及其制品味道鮮美，營養豐富，深受人們的喜愛，但卻因具有較高的致敏性，影響了過敏人群的食用。據統計，對蝦等甲殼類動物引發的過敏反應廣泛存在于全球各個國家當中，最高可占食物過敏總人口的30％以上，食物過敏的兒童中對蝦等甲殼類過敏的比例甚至高達60％以上。進一步分析顯示，原肌球蛋白是引起人們甲殼類水產食品過敏反應的主要原因之一，能夠引起過敏性皮炎、支氣管哮喘、過敏性腹瀉等癥狀，嚴重威脅到人們的健康，且不同對蝦品種以及其他甲殼類動物的原肌球蛋白具有一定的同源性，能夠引起一定的交叉反應，最終加大了這類人群的過敏反應，因此如何緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應引起了廣泛的關注。

目前緩解和控制對蝦等食品過敏普遍采用的方法包括物理法、化學法和生物法，均可以顯著降低過敏原的免疫活性。其中物理法包括加熱、輻照、微波以及超高壓等，化學法包括強酸水解、靶向美拉德反應，生物法多采用酶解法，是目前新興的一種方法，具有一定的應用前景。

但是以上方法均不能從根本上緩解或者控制對蝦等食品過敏，一方面在消除對蝦等食品過敏原本身的同時，由于食品不同的基質和自身的結構差異，并不能很好的完全去除過敏原；另一方面改變了食品原有的結構和感官性狀，進而影響了作為商品的原有價值。

發明內容

針對現有技術存在問題，本發明提供一種用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應的改良蛋白dMet e 1以及其制備方法。

一種用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應的改良蛋白dMet e 1，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

一種如所述改良蛋白dMet e 1的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)切除新對蝦屬(Metapenaeus)原肌球蛋白Met e 1序列中的九個抗原特異性表位氨基酸殘基序列得到改良蛋白dMet e 1氨基酸序列，并對所得改良蛋白dMet e 1氨基酸序列通過逆向翻譯轉錄得到dMet e 1核酸序列，然后合成對應的cDNA；

(2)將所得cDNA與載體質粒通過限制性內切酶處理并結合，獲得重組質粒載體并導入宿主菌，經表達純化得到改良蛋白dMet e 1。

為了緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應，本研究結合前期的實驗，通過針對性將新對蝦屬原肌球蛋白Met e 1(SEQ ID NO：1)九個抗原特異性表位氨基酸殘基切除，制備了一種可用于緩解對蝦原肌球蛋白致敏反應的改良蛋白dMet e 1，實驗結果表明，可以通過調節免疫耐受，從而降低過敏反應。為從過敏人群角度從本質上解決對蝦等食品過敏問題提供了依據。

本發明采用基因工程的方法，以新對蝦屬原肌球蛋白Met e 1為基礎，刪除其蛋白表明九個抗原特異性結合位點(E1:25-30、E2:43-60、E3:87-103、E4:146-154、E5:161-165、E6：191-211、E7:236-241、E8：247-255、E9：269-281)得到僅有171個氨基酸殘基的改良蛋白dMet e 1氨基酸序列，并通過逆向轉錄翻譯得到其cDNA并合成重組質粒導入宿主菌進行表達，經純化得到改良蛋白標準品。本制備方法具有產量高，生產穩定，成本低的特點。通過小鼠模型以及患者血清ELISA試驗證明改良蛋白dMet e 1對對蝦原肌球蛋白引起的過敏反應有明顯的抑制效果，且不引起相關的交叉反應。

逆向翻譯轉錄得到dMet e 1核酸序列并合成對應的cDNA由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

獲得全長cDNA基因序列后，在序列兩端引入限制性內切酶EcoRV及HindⅢ酶切位點，與Pet30(a)+原核表達載體酶切、連接，使得插入片段的起始密碼子位于翻譯的起始密碼子位置，構建重組質粒；將構建的重組質粒導入大腸桿菌BL21(DE3)菌株，然后置于大腸桿菌表達培養基MagicMedia上37℃下培養過夜；組氨酸標記大腸桿菌BL21(DE3)菌株表達出的dMet e 1，并通過純化柱HisPur Cobat Spin Column進行純化。

純化后的蛋白通過SDS-PAGE對蛋白進行純度、分子量進行檢測。