[發明專利]一種原代鴨肝細胞的分離及培養方法

在審

• 申請號: 201710255944.7
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN108728398A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 不公告發明人
• 申請（專利權）人: 江蘇齊氏生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種原代鴨肝細胞的分離及培養方法，包括以下步驟：(1)選取1~2月的雄性重慶麻鴨，腹腔注射戊巴比妥鈉和肝素；(2)將麻鴨麻醉后腹面向上固定于板上，無菌條件下切開腹腔；(3)靜脈插管，用恒流泵灌注預熱的HBSS緩沖液；(4)用恒流泵灌注預熱的GBSS緩沖液；(5)用恒流泵灌注預熱的GBSS混合酶溶液；(6)剪碎組織用GBSS混合酶液振蕩消化，篩網過濾，離心，棄上清；(7)取細胞濾液用錐蟲藍染色檢測細胞活性；(8)細胞計數后用完全培養基重懸接種到包被后的培養瓶，置于37℃、5% CO₂環境中培養；(9)細胞形態鑒定；(10)ELISA法檢測；(11)RT?PCR檢測。本發明提供的一種鴨肝細胞的分離及培養方法，操作簡單，所得細胞數量多，成活率高，是一種理想的原代鴨肝細胞分離與培養方法，為實驗提供可靠的細胞資源。

技術領域

本發明屬于現代生物技術之細胞培養技術領域，具體涉及一種原代鴨肝細胞的分離及培養方法。

背景技術

鴨乙型肝炎病毒(DHBV)和人乙型肝炎病毒(HBV)同屬嗜肝DNA病毒科。由于DHBV和HBV十分相似，在HBV致病機理及其治療研究過程中，DHBV感染鴨模型在動物實驗模型中得到廣泛應用。DHBV感染可以作為HBV感染人所致肝病的發病機制、篩選治療人病毒性肝炎藥物等的實驗動物模型。研究DHBV感染可以間接認識HBV，本發明建立的原代鴨肝細胞的培養方法是研究HBV的一個重要工具，為篩選抗病毒藥物提供了良好的體外培養條件。

目前肝細胞的分離方法有機械分離法、螯合法和酶消化法等。機械法操作簡單，但分離獲得的肝細胞數量少、活性差。Howard創建了膠原酶灌流法，Seglen進一步將這種方法發展為兩步灌流法。膠原酶灌流法 得到的肝細胞數量和活性都得到提高，灌流法廣泛應用于大鼠、小鼠、犬和兔等動物。

本發明在傳統灌流法的基礎上采用三步灌流法，旨在提供一種操作簡單、高效的獲得生長狀態好、純度高的原代鴨肝細胞的方法，建立一套完善可靠的原代鴨肝細胞體外培養技術。

發明內容

根據上述問題，本發明提供了一種鴨原代肝細胞的分離及培養方法，該方法操作簡單，細胞產量和成活率高，是一種較為理想的原代鴨肝細胞培養方法，可以滿足多種生理生化實驗的要求。

一種原代鴨肝細胞的分離及培養方法步驟包括：(1)選取1~2月的雄性重慶麻鴨，腹腔注射戊巴比妥鈉和肝素；(2)將麻鴨麻醉后腹面向上固定于板上，無菌條件下切開腹腔；(3)靜脈插管，用恒流泵灌注預熱的HBSS緩沖液；(4)用恒流泵灌注預熱的GBSS緩沖液；(5)用恒流泵灌注預熱的GBSS混合酶溶液；(6)剪碎組織用GBSS混合酶液振蕩消化，篩網過濾，離心，棄上清；(7)取細胞濾液用錐蟲藍染色檢測細胞活性；(8)細胞計數后用完全培養基重懸接種到包被后的培養瓶，置于37℃、5% CO₂環境中培養；(9)細胞形態鑒定；(10)ELISA法檢測；(11)RT-PCR檢測。

其中，步驟 (1) 所述的戊巴比妥鈉濃度為30 mg/kg體重，肝素100 U/kg體重。

其中，步驟(3)所用的HBSS緩沖液(PH為7.2~7.4)含1%~5%的BSA以保持細胞的活性，防止酶的分解和非特異性吸附。

其中，步驟(3)和(4)所用的所用恒流泵灌注速度為5~15 ml/min，灌注時間5~20min，灌注量40~60 ml。

其中，步驟(5)和(6)所用GBSS混合酶液(PH為7.2~7.4)為含0.1%~0.5%Ⅳ型膠原酶和0.002%~0.006% DNaseⅠ的溶液。

其中，步驟(5)所用恒流泵灌注速度為20~40 ml/min，灌注時間10~30 min，灌注量40~60 ml。

其中，步驟(6)所述振蕩消化時間10~30 min，80~200目篩網過濾。