[發明專利]一種特異結合膜聯蛋白A2的核酸適體wh3及用途

有效

• 申請號: 201710255793.5
• 申請日: 2017-04-19
• 公開（公告）號: CN107083388B
• 公開（公告）日: 2020-05-08
• 發明（設計）人: 劉靜;周衛華;葉茂;蕭小鵑;張毅彬;曾亞悅
• 申請（專利權）人: 中南大學;湖南大學
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/68;G01N33/574;C07K14/47;C07K1/14;A61K31/7088;A61P35/00
• 代理公司: 北京知本村知識產權代理事務所(普通合伙) 11039
• 代理人: 劉江良

本發明公開了特異結合膜聯蛋白A2(Annexin A2,ANXA2）的核酸適體wh3及其應用，wh3序列如SEQ ID NO.3所示，該核酸適體能夠與ANXA2特異結合，因此可以用于ANXA2的純化和濃縮，也可以與治療藥物結合后作為靶向ANXA2的藥物,進一步研究表明wh3能阻斷ANXA2的作用，抑制多發性骨髓瘤（Multiple Myeloma，MM）細胞的生長和粘附且可作為ANXA2定量或定性檢測試劑，應用前景廣泛。

技術領域

本發明屬于適體領域，具體涉及特異結合膜聯蛋白A2的核酸適體，還涉及該核酸適體的應用。

背景技術

膜聯蛋白A2(Annexin A2，ANXA2)是由339個氨基酸組成的分子量為36 kDa的蛋白質, 是一種Ca²⁺依賴性磷脂結合蛋白，在細胞中可以單體(p36)、異源二聚體(p36/p11)和異源四聚體(p362/p112)三種形式存在。它在結構上高度保守并且在幾乎所有真核生物中表達，主要分布在細胞膜、細胞漿中，一小部分存在于細胞核中。ANXA2 主要表達于內皮細胞、單核細胞、巨噬細胞、神經細胞和某些腫瘤細胞中，在腦癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌、肺癌和結腸癌以及血液腫瘤中表達上調。ANXA2在腫瘤中的高表達與腫瘤的發生、發展、浸潤、轉移及預后密切相關。ANXA2在高侵襲、高轉移的惡性腫瘤中高表達，提示ANXA2有望成為判斷腫瘤浸潤和轉移能力及腫瘤病人預后的標志物，可作為腫瘤治療潛在的靶分子，該核酸適體可用于腫瘤早期檢測及治療。

目前，ANXA2的檢測方法主要有免疫組化法，酶聯免疫法等免疫學檢測法。依賴抗體的免疫學檢測法操作簡單，靈敏度高，無需大型昂貴儀器設備，適用于大量樣品的檢測，但是這種方法檢測的假陽性率比較高，定量也不夠準確。并且檢測所用抗體等試劑穩定性差，儲存條件較DNA核酸適體嚴格。核酸適體能與各種有機物或無機物靶標分子高特異性、高親和力結合，同時具有分子量小，免疫原性低，穩定性好，制備和標記方便等優點。核酸適體作為抗體分子的替代分子，在疾病的診斷和治療中發揮重要作用。但迄今尚無針對ANXA2的DNA核酸適體報道或公開，因此有必要開發一種可特異結合ANXA2的核酸適體。

發明內容

有鑒于此，本發明目的在于提供特異結合并作用ANXA2的核酸適體。

本發明人采用消減篩選的策略，利用GST-ANXA2融合蛋白作為篩選靶標，可獲得與融合蛋白結合的DNA序列，通過將GST蛋白作為負性篩選，將與GST蛋白結合的DNA序列去除，從而得到能與ANXA2蛋白特異結合的核酸適體，通過篩選獲得了一條特異結合ANXA2的核酸適體（命名為wh3）。所述核酸適體的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本發明提供所述特異結合ANXA2的核酸適體wh3在制備檢測ANXA2試劑中的應用。具體地，通過將ANXA2蛋白與酶標板結合，然后利用生物素標記的wh3核酸適體孵育結合；PBS洗板后，加入過氧化物酶標記的鏈霉親和素孵育，加入過氧化物酶的底物顯色，通過酶標儀檢測并計算ANXA2的濃度。

本發明提供特異結合ANXA2的核酸適體wh3在純化和濃縮ANXA2中的應用。具體地，ANXA2蛋白與生物素標記的wh3核酸適體結合，然后加入鏈霉親和素磁珠孵育，通過磁粉可將ANXA2純化和濃縮。

本發明提供特異結合ANXA2的核酸適體在制備靶向ANXA2藥物中的應用。具體而言，細胞膜表面的ANXA2蛋白能與多種蛋白結合發揮其生理作用，，wh3能與ANXA2蛋白結合，可能阻斷ANXA2蛋白與其它蛋白的相互作用，其功能表現為wh3阻斷ANXA2蛋白促進MM.1S和RPMI-8226細胞的生長，wh3能抑制MM1.S和RPMI-8226細胞對ANXA2蛋白的粘附作用。

本發明的有益效果在于：