[發明專利]一種源于雞傳染性貧血病毒VP1-aa 1-19多肽作為高效細胞穿膜肽的應用

有效

• 申請號: 201710248387.6
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106831957B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發明（設計）人: 葉建強;呼高偉;邵紅霞;秦愛建;劉敏;申秋平;田曉彥;金甫
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01
• 代理公司: 32207 南京知識律師事務所
• 代理人: 盧亞麗<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明涉及一種源于雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP1?aa 1?19多肽作為高效細胞穿膜肽的應用。所述VP1?aa 1?19多肽序列如SEQ ID NO.2所示。該多肽可以攜帶FITC在30min內進入293T細胞、HCT?116細胞、3T3細胞、MDCK細胞、MSB1細胞，而且穿膜效率與穿膜肽濃度呈正相關性，關鍵特點其可高效進入懸浮培養細胞。結合激光共聚焦顯微鏡和流式細胞術結果顯示，雞傳染性貧血病毒VP1?aa 1?19多肽的穿膜效率明顯高于TAT短肽。

技術領域

本發明涉及一種源于雞傳染性貧血病毒(Chicken anemia virus,CAV)VP1-aa 1-19多肽的高效細胞穿膜肽。該多肽可攜帶FITC在30min內穿入不同的細胞(包括貼壁細胞以及懸浮細胞)。與TAT的比較發現，該多肽對FITC的細胞穿膜功能明顯高于TAT。因此，本發明獲得的一種源于雞傳染性貧血病毒VP1-aa 1-19多肽的高效細胞穿膜肽具有一定的應用前景與價值。

背景技術

細胞穿膜肽(Cell penetrating peptides，CPPs)是一類可攜帶生物大分子進入細胞的短肽，長度一般為5-30個富含帶正電荷的堿性氨基酸。它不僅自身可以高效的穿過細胞膜進入細胞，還可將不同種類的外源分子例如熒光素、DNA、RNA、蛋白質、量子點等高效攜帶進入不同物種的細胞。因這種新型的短肽不僅具備傳導效率高、生物毒性低、避免激發體內免疫反應、而且穿膜細胞目標廣泛和應用靈活的特點，所以是近20年來快速發展的一類新型外源基因或藥物傳導載體。

根據穿膜肽結構的理化特性，可將其分為陽離子型、兩性分子型和疏水型3種。當前陽離子型CPPs的代表TAT短肽是目前研究最熱的穿膜肽之一。但TAT短肽包含2個Furin酶識別切割位點(即RKKR和RQRR)，因此TAT在穿膜過程中會被Furin水解而破壞TAT結構，從而減弱其穿膜能力。一種新型、安全高效的細胞穿膜肽有待被挖掘出來。

發明內容

本發明的目的是提供一種新的安全高效的細胞穿膜肽。

本發明對雞傳染性貧血病毒VP1蛋白N端富含精氨酸序列區(aa 1-60)進行分析設計出具有潛在細胞穿膜功能的多肽(aa 1-19)，經FITC標記后，人工合成。將合成的多肽與不同細胞共孵育，采用激光共聚焦顯微鏡、流式細胞術和細胞毒性試驗鑒定和驗證其穿膜功能和穿膜特性，比較其穿膜效率，并評價其安全性。數據顯示，其可攜帶FITC在30min內穿入不同的細胞，包括懸浮培養細胞。而且經比較研究發現，VP1-aa 1-19多肽的細胞穿膜效率明顯高于TAT。

本發明公開了源于雞傳染性貧血病毒VP1-aa 1-19多肽作為高效細胞穿膜肽的應用，所述VP1-aa 1-19多肽序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明所述的應用，具體是VP1-aa 1-19多肽經FITC標記后，攜帶FITC在30min內穿入不同的細胞。所述細胞包括人結腸癌細胞(HCT-116)、小鼠胚胎成纖維細胞(3T3)、人腎上皮細胞(293T)、犬腎細胞(MDCK)、雞馬立克氏病淋巴瘤細胞(MSB1)。

(1)雞傳染性貧血病毒VP1-aa 1-19多肽的合成和穿膜功能的鑒定

結合UniProt數據庫和在線服務器MultiAlin對不同參考株CAV VP1 N端富含精氨酸區域序列區(aa 1-60)進行比對和分析。根據細胞穿膜肽的特性(富含5-30個正電荷氨基酸)，進行設計與生成擬細胞穿膜肽序列(aa 1-19)。經FITC標記后，人工合成。同時以TAT穿膜肽作為陽性對照。將合成的不同短肽分別與293T細胞、HCT-116細胞、3T3細胞、MDCK細胞、MSB1細胞進行共孵育，利用激光共聚焦顯微鏡和熒光顯微鏡鑒定其穿膜功能。

(2)雞傳染性貧血病毒VP1-aa 1-19多肽的穿膜特性與穿膜效率的比較