[發明專利]一種特異性核酸適配體及應用

在審

• 申請號: 201710247214.2
• 申請日: 2017-04-17
• 公開（公告）號: CN106929510A
• 公開（公告）日: 2017-07-07
• 發明（設計）人: 諶志強;邱志剛;李君文;金敏;楊棟;劉偉麗;王景峰;江建華
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所
• 主分類號: C12N15/115
• 分類號: C12N15/115;G01N33/569
• 代理公司: 天津市三利專利商標代理有限公司12107
• 代理人: 李蕊

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其是一種特異性核酸適配體及應用。

背景技術

腸出血性大腸桿菌O157∶H7(Enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC是一種有鞭毛、無芽孢、可運動的革蘭氏陰性菌，它是腸出血性大腸桿菌的一個主要菌型。自1982年首次在美國被確認并分離以來，在世界范圍內引起廣泛傳播。大腸桿菌O157:H7主要可引起人類腹瀉、出血性結腸炎、溶血性尿毒綜合征以及血栓形成性血小板減少性紫癜等，死亡率高達30％。大腸桿菌O157:H7在自然界中分別較廣，感染后致病力較強，僅數十個活菌就可引發胃腸道感染。在我國，大腸桿菌O157:H7是現有的對國民健康造成重大威脅的致病原之一。因此、高效、快速、靈敏地檢測大腸桿菌O157:H7的方法是亟待需要的。

傳統的大腸桿菌O157∶H7檢測方法主要包括選擇性培養基分離培養法，生化方法等，這些方法大多操作步驟繁瑣，且耗時較長。隨著科學技術的發展，出現了一些新興檢測方法,如以PCR為基礎的分子生物學法,免疫學方法，流式細胞儀法及基因芯片法等，這些方法同樣也存在著儀器昂貴，操作復雜，費時等缺點。

核酸適配體是通過指數級富集配體的系統進化技術(Systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX)，從體外人工合成的核酸文庫中篩選得到的高親和力、高特異性結合靶分子的單鏈寡核苷酸，包括ssDNA、RNA和修飾RNA。適配體因其單鏈結構，可以形成豐富的自適應的三維空間結構與靶分子結合，擴大了靶分子的范圍。此外，核酸適配體還具有穩定性好、易于修飾和保存、無免疫原性的特點。結合適配體的優點，在眾多的檢測領域中，適配體作為一種新型的識別元件已經成為高效、快速檢測技術研究的焦點。因此，篩選大腸桿菌O157:H7的特異性核酸適配體并且建立基于適配體的大腸桿菌O157:H7的快速檢測技術具有重要的應用價值。

發明內容

本發明所要解決的技術問題在于提供一種特異性核酸適配體，能夠特異性結合大腸桿菌O157:H7。

本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述特異性核酸適配體的應用。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：

一種特異性核酸適配體，能夠與腸出血性大腸桿菌O157:H7特異性結合，所述核酸適配體(A46)的核苷酸序列為序列表<400>1所示序列。

優選的，上述核酸適配體A46，所述的核酸適配體為人工合成或PCR擴增或切膠回收單鏈DNA純化后獲得，該核酸適配體為單鏈DNA，由88個核苷酸組成，其一級結構為直鏈狀；二級結構為莖環，最小自由能為11.96kcal/mol。

優選的，上述核酸適配體(A46)，可用修飾材料對所述核酸適配體A46進行修飾，所述修飾材料為功能基團、納米材料和/或蛋白類材料。

上述核酸適配體(A46)在制備對腸出血性大腸桿菌O157:H7定性和定量檢測試劑中的應用，例如，可廣泛應用于熒光檢測方法、酶聯免疫方法以及生物傳感器中。

優選的，上述核酸適配體(A46)的應用，所述腸出血性大腸桿菌O157:H7為純標本或食物中腸出血性大腸桿菌。

本發明的有益效果是：

所述核酸適配體利用全菌消減SELEX技術篩選而得，分子量較小，易于合成與修飾，能夠高特異性識別并且高親和力結合腸出血性大腸桿菌O157:H7，與其他細菌并不發生特性結合，可用于檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7，對于有效地預防及控制大腸桿菌O157:H7感染具有重要意義。

附圖說明

圖1為熒光結合率實驗監測適配體篩選過程中每一輪文庫與腸出血性大腸桿菌O157:H7結合效率圖。

圖2為腸出血性大腸桿菌O157:H7核酸適配體的二級結構預測圖。

圖3為腸出血性大腸桿菌O157:H7與其核酸適配體的解離常數擬合曲線圖。

圖4為熒光化學分析法檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7適配體的特異性圖。

圖5為流式細胞術檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7適配體的特異性圖。

圖6為激光共聚焦顯微鏡方法檢測檢測腸出血性大腸桿菌O157:H7適配體的特異性圖，對于激光共聚焦顯微鏡下觀察適配體A46特異性結果分析(a～e)中，L-代表白光激發；F-代表熒光激發；M-代表白光與熒光激發重疊結果。

圖7為基于適配體構建的納米磁珠-適配體熒光檢測方法的標準曲線圖。

具體實施方式