[發明專利]一種利用CRISPR系統產生多樣性抗體文庫的方法

在審

• 申請號: 201710245652.5
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN108728476A
• 公開（公告）日: 2018-11-02
• 發明（設計）人: 劉贇;徐值姣;應天雷
• 申請（專利權）人: 復旦大學
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 上海元一成知識產權代理事務所(普通合伙) 31268
• 代理人: 吳桂琴

本發明屬生物技術領域及基因工程技術領域，涉及抗體制備技術，具體涉及一種利用CRISPR系統產生多樣性抗體文庫從而篩選高親和力抗體的方法。該方法利用CRISPR系統的剪切及后續NHEJ修復的途徑，實現對抗體基因的可變區區域產生蛋白質序列的多樣性，從而產生新抗體文庫，為后續抗體篩選做準備。本發明方法比以往用易錯pcr來形成抗體庫及定向突變堿基替代等方法改進抗體庫相比，產生的抗體庫容大且多樣化，打破抗體篩選時庫容的限制，本方法通過調節CRISPR的表達，可循環產生新文庫直至篩選出理想抗體，操作周期短，成本低，方便靈活。

技術領域

本發明屬生物技術領域及基因工程技術領域，涉及抗體制備技術，具體涉及一種利用CRISPR系統產生多樣性抗體文庫從而篩選高親和力抗體的方法。

背景技術

現有技術公開了Kohler和Milstein發明了單克隆抗體技術(1975年)，并在1984年獲得了諾貝爾獎。因此，抗體對抗原的結合能力，使其在疾病診斷的免疫防治中具有重要意義。實踐證實，抗體尤其是單克隆抗體已成為目前生物醫藥產業最具前景和應用價值的領域。現有技術公開了早年單抗的制備是B淋巴細胞和骨髓瘤細胞雜交形成的雜交瘤細胞產生的，其重鏈和輕鏈所形成的結構域可以識別和結合特異抗原。1998年，全球第一個人源化單克隆抗體帕利珠單抗(Palivizumab,商品名:Synagis),被美國食品藥品管理局FDA批準上市,截至目前,FDA已批準上市了66個抗體藥物。克隆抗體藥物以其高特異性、有效性和安全性正在發展成為國際藥品市場上一大類新型診斷和治療藥物，日益成為癌癥及其他疾病治療市場的新寵。因此，改進篩選和制備高效安全的單克隆抗體技術意義重大。

隨著基因工程技術的迅速發展，治療性單抗經歷了早期100％的鼠源單抗，到嵌合抗體，人源化抗體，到近年的全人源性抗體幾個時期，逐步消除了異源性抗體的免疫原性問題，在保持對抗原高親和力的同時，改善了抗體的藥代動力學。通過對抗體基因的改造，尤其是高變區基因，產生大量不同抗體文庫是篩選高親和力目標抗體的基礎，如今多使用易錯PCR技術擴大庫容及定向突變堿基替代方法對可變區序列進行改進以提高親和力，但這些方法相對局限并繁瑣，周期長，成本高，限制了篩選高親和力抗體的應用。

CRISPR系統是一種精確的萬能基因武器，可以用來刪除、添加、激活或抑制其他生物體的目標基因，這些目標基因包括人、老鼠、斑馬魚、細菌、果蠅、酵母、線蟲和農作物細胞內的基因，這也意味著此基因編輯器是一種可以廣泛使用的生物技術。

本領域公知，抗體文庫的多樣化及庫容容量是后續篩選理想抗體的基礎和關鍵。

基于現有技術的基礎，本發明擬提供一種利用CRISPR系統產生多樣性抗體文庫從而篩選高親和力抗體的方法。

發明內容

本發明的目的在于，基于現有技術的基礎，旨在提供一種利用CRISPR系統產生多樣性抗體文庫從而篩選高親和力抗體的方法。尤其涉及一種靈活簡便的方法用于針對抗體基因高變區序列進行編輯并產生多樣化新抗體文庫，用于后續高親和力抗體的篩選。該方法利用CRISPR系統的剪切及后續NHEJ修復的途徑，實現對抗體基因的可變區區域產生蛋白質序列的多樣性，從而產生新抗體文庫，為后續抗體篩選做準備。

本發明方法比以往用易錯pcr來形成抗體庫及定向突變堿基替代等方法改進抗體庫相比，產生的抗體庫容大且多樣化，打破抗體篩選時庫容的限制，而且本方法通過調節CRISPR的表達，可循環產生新文庫直至篩選出理想抗體，操作周期短，成本低，方便靈活。

為實現上述目的，本方法通過下述方法和步驟實現：

1、質粒的構建，包括選擇性表達含有CRISPR系統的質粒及選擇性表達抗體基因的展示質粒：

1)本發明所述的選擇性表達含CRISPR系統的質粒(簡稱CRISPR質粒)質是指利用四環素系統或其它系統調節CAS9或sgRNA表達的質粒；可以根據初始抗體可變區特點設計多個sgRNA靶向序列；