[發明專利]一種能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法

在審

• 申請號: 201710245445.X
• 申請日: 2017-04-14
• 公開（公告）號: CN107087570A
• 公開（公告）日: 2017-08-25
• 發明（設計）人: 尤佳;王從麗;胡巖峰;李春杰
• 申請（專利權）人: 中國科學院東北地理與農業生態研究所
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;A01G31/00
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所23109
• 代理人: 侯靜

技術領域

本發明涉及一種大豆孢囊線蟲抗性篩選方法。

背景技術

大豆孢囊線蟲(Soybean Cyst Nematode，SCN，Heterodera glycines Ichinohe)是一種植物寄生線蟲，主要寄生在豆科植物的根部，嚴重阻礙植株的生長，導致產量下降，造成巨大的經濟損失。

目前，選用大豆抗孢囊線蟲品種是最經濟有效的手段，而篩選大豆孢囊線蟲抗病品種主要通過溫室盆栽法，即普遍采用的塑料缽柱法和PVC管法，即將滅菌的沙和土按照體積比1:1比例混合后裝入營養缽或PVC管，把1粒大豆種子種植在混合好的沙土中，萌發后，待子葉展開后接種大豆孢囊線蟲二齡幼蟲，接種21天后，用大量的清水輕柔的沖洗大豆的根部，將泥沙沖洗干凈后統計根上孢囊數目。

現有方法存在以下問題：1)、由于大豆是種植在沙土中，統計孢囊數需要用大量的水沖洗，且沖洗時需要格外小心避免孢囊掉落，但仍會有部分孢囊損失，需要大量勞動力，且操作時間長；2)、大豆根不易徹底沖洗干凈，為統計孢囊數目增加難度，統計出來的孢囊數平行性差；3)、脫落在土中的雄蟲難以獲得；4)、群體遺傳抗性研究需要進行大批量植株后代篩選，而營養缽以及PVC管占用空間大；5)、試驗過程需要大量的滅菌沙和土，沙和土的運輸、篩選、滅菌和裝灌環節多，并且耗時耗人力。另外，對大豆孢囊線蟲侵染、致病機理方面的深入研究過程中，需要大量的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲、雌蟲、雄蟲或孢囊，用沙土法繁殖需要空間大，耗時耗力。所以需要一種簡易的，省時省力省空間的培養方法。

發明內容

本發明是要解決現有方法存在統計孢囊數目難度大，費時費力，雄蟲難以獲得，培養占用空間大的問題，提供能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法。

本發明能夠同時繁殖大豆孢囊線蟲并進行大豆孢囊線蟲抗性篩選方法，包括以下步驟：

一、首先將雙層濾紙重疊放置于培養袋內，培養袋開口向上，濾紙上部與培養袋開口處高度一致；所述培養袋為扁平的塑料袋；

二、用移液器向培養袋加入無菌水9～11mL，使培養袋中的濾紙充分浸濕，且保證培養袋底部有少量無菌水存留；

三、將大豆幼苗移到浸濕的濾紙上部，使幼苗的根部通過濾紙的空隙放入培養袋中，保持子葉高于培養袋的上邊緣，然后將培養袋豎直放入夾子內，每個夾子中放置兩個培養袋，然后將夾子懸掛在培養架上，再將整個培養架置于培養箱中，光照周期為：16h光照，8h黑暗，晝夜溫度分別為24℃和22℃，每天向每個培養袋內澆無菌水3-5ml，每三天向每個培養袋內澆5～6mL霍格蘭氏營養液，每天保持培養袋底部略有存水，濾紙保持濕潤，第二天存水恰好蒸發完為宜。

四、植株繼續生長5-7天，之后從夾子中取出培養袋，向大豆的主根和側根周圍均勻滴入3mL 100條/mL的大豆孢囊線蟲二齡幼蟲懸浮液，然后將培養袋水平放置在培養箱中進行暗培養，24h后取出培養袋豎直放入培養架的夾子中，在培養箱中繼續光照培養15～21天；

五、用無菌水在培養袋內沖洗根表面，然后將培養袋內的無菌水收集至滅菌的容器中，完成雄蟲收集，在接種大豆孢囊線蟲21天后，將培養袋內的濾紙連同大豆的整個根系取出，剪去地上部分，平鋪在實驗臺上，進行孢囊數目統計，然后根據孢囊數目和感病對照品種的孢囊數目比較確定大豆孢囊線蟲抗性品種，除去用于統計的孢囊數的樣品，剩余的樣品在接種大豆孢囊線蟲40-45天收集成熟孢囊，用于后續的研究。

其中確定大豆孢囊線蟲抗性品種的方法為：根據Schmitt and Shannon，1992劃分方法，雌蟲指數(Female Index，FI)<10為抗，FI＝10-30為中抗，FI＝31-60為中感，FI>60為感病。

進一步的，所述濾紙的長為15～18cm，寬為12～14cm。

進一步的，所述培養袋的長為17～19cm，寬為16～18cm。

進一步的，所述培養袋的材質為塑料。

進一步的，所述大豆幼苗為在蛭石中萌發3-5天的，全株長7～9cm的幼苗。

進一步的，步驟三所述培養架包括底板、側柱、支撐桿、懸掛桿和提手，所述底板為矩形底板，底板的四個角上分別豎直設置4個側柱，所述支撐桿水平設置在側柱的上部，支撐桿的兩端分別與相鄰的兩個側柱固定連接，側柱上對稱設置2個支撐桿，所述懸掛桿水平設置在側柱的上部，懸掛桿的兩端分別與相鄰的兩個側柱固定連接，側柱上對稱設置2個懸掛桿，所述懸掛桿與支撐桿相鄰，所述支撐桿上部分別設有提手。