[發(fā)明專利]一種適合HEK293細胞的雙順反子表達載體及其制備方法、表達系統(tǒng)、應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201710240457.3
• 申請日: 2017-04-13
• 公開（公告）號: CN107058387B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發(fā)明（設計）人: 王天云;林艷;井長勤;李琴;王建華;郭夢龍
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/65
• 代理公司: 鄭州睿信知識產(chǎn)權代理有限公司 41119
• 代理人: 張鵬輝

本發(fā)明涉及一種適合HEK293細胞的雙順反子表達載體及其制備方法、表達系統(tǒng)、應用，屬于基因工程技術領域。本發(fā)明的適合HEK293細胞的雙順反子表達載體，包含如下元件：第一核基質(zhì)結合區(qū)序列?啟動子?目的基因?內(nèi)部核糖體進入位點序列?篩選標記基因?Poly A–第二核基質(zhì)結合區(qū)序列。該載體利用優(yōu)化的MAR序列可以顯著提高HEK293細胞轉基因表達，克服轉基因沉默，實現(xiàn)轉基因在宿主細胞中的高效、長期表達。同時可實現(xiàn)目的基因和篩選標記的同時表達，可減少由于不同表達框存在導致的假陽性細胞克隆，提高陽性細胞克隆篩選率，并克服傳統(tǒng)載體目的基因與篩選標記基因表達不均衡的問題。

技術領域

一種適合HEK293細胞的雙順反子表達載體及其制備方法、表達系統(tǒng)、應用，屬于基因工程技術領域。

背景技術

20世紀70年代基因工程技術的發(fā)展，使原來利用動物臟器、組織或人類血液提取蛋白質(zhì)藥物轉變?yōu)槔没蚬こ躺a(chǎn)。藥物蛋白包括單克隆抗體、多肽、蛋白，已經(jīng)成為醫(yī)藥工業(yè)的重要部分，并將成為未來醫(yī)藥發(fā)展的重要領域。

重組藥物蛋白的表達系統(tǒng)主要包括E.coli、酵母以及非人源化哺乳動物細胞系。E.coli適合表達分子量較小、結構相對簡單的蛋白質(zhì)，酵母表達系統(tǒng)適合表達分子量較大、結構較復雜、較少糖基化的蛋白質(zhì)。結構復雜或糖基化修飾對于蛋白質(zhì)的活性非常重要，非人源化哺乳動物細胞由于具備類似于人類細胞的翻譯后加工修飾(post-translationalmodifications，PTMs)，因此，非人源化哺乳動物細胞表達系統(tǒng)是目前藥物重組藥物蛋白生產(chǎn)的重要平臺。常用的非人源化哺乳動物細胞主要包括：如中國倉鼠卵巢(Chinesehamster ovary,CHO)、乳倉鼠胚腎細胞(Baby Hamster Kidney，BHK)、NSO小鼠胸腺瘤細胞、SP2/0骨髓瘤細胞、NSO小鼠骨髓瘤細胞。盡管非人源化哺乳動物類細胞表達重組藥物蛋白具備安全性和有效性，但是由于PTMs方式不同，尤其是糖基化修飾與人源細胞存在差別。如鼠類細胞缺乏人源細胞的糖基化的機制，表達蛋白容易使人體產(chǎn)生免疫性，導致外來的重組藥物蛋白被循環(huán)系統(tǒng)清除。HEK293細胞來源于人胚腎細胞，最早由Graham于1977年利用轉染腺病毒5型DNA獲得，近年來被應用于重組藥物蛋白和病毒載體的生產(chǎn)。HEK293能夠在SFM懸浮生長、易轉染，具備生產(chǎn)重組藥物蛋白的優(yōu)點。對HEK293細胞進行馴化和改造，已經(jīng)培育出能在SFM生長迅速、轉染效率高、表達水平高的細胞系。迄今已有5種由HEK293細胞系生產(chǎn)的藥物蛋白獲美國FDA或EMA批準生產(chǎn)。

HEK293細胞表達系統(tǒng)也存在目的蛋白表達水平低、高產(chǎn)穩(wěn)定細胞篩選周期長、細胞培養(yǎng)成本高等缺陷，這嚴重制約著重組蛋白藥物的生產(chǎn)。而影響重組蛋白在HEK293細胞中表達的因素眾多，表達載體就是其中一個重要因素。此外，在細胞表達系統(tǒng)中，高水平持續(xù)穩(wěn)定表達的細胞株往往難以得到，這是因為轉基因轉染細胞后的隨機整合，使有些轉基因發(fā)生沉默或者表達水平降低，因此需要從大量細胞克隆株中分離出穩(wěn)定高效表達的克隆細胞株，這也給基因工程產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)帶來了很大困擾。