[發明專利]一種利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法

在審

• 申請號: 201710238117.7
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN106841371A
• 公開（公告）日: 2017-06-13
• 發明（設計）人: 孫麗偉;江文靜
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙)32204
• 代理人: 肖明芳

1.一種利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)對待鑒別藍藻細胞樣品進行前處理；

(2)將步驟(1)處理后的樣品滴入樣品板上，再滴入基質溶液，室內風干；

(3)將步驟(2)得到的樣品板放入飛行時間質譜測定儀進行測定，以核糖體蛋白質作為生物標識物，測定出的圖譜與所選擇的特征核糖體蛋白理論峰值進行比對后實現對藍藻種類的鑒別。

2.根據權利要求1所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的前處理，無需提純蛋白質，只需破碎和離心即可。

3.根據權利要求2所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的前處理具體過程為：將樣品進行超聲波除泡，離心后去除上清液，取沉淀物離心后再取沉淀，所得沉淀加入TMA-1緩沖液混勻，移入裝有氧化鋯-二氧化硅微粒的細胞破碎專用離心管，置入細胞破碎儀進行機械破碎；將機械破碎后的樣品低速離心后取上清液；上清液再經高速離心后獲得核糖體亞單位沉淀物。

4.根據權利要求3所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，所述的TMA-1緩沖液為含10mM pH 7.8Tris-HCl緩沖液，30mM的氯化銨，10mM的氯化鎂以及6mM的2-巰基乙醇。

5.根據權利要求2所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，所述的低速離心，離心條件為5800g，4℃，離心25分鐘；所述的高速離心，離心條件為64000g，4℃，離心4小時。

6.根據權利要求1所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(2)中，將步驟(1)處理后的樣品加入混合液A混勻后，再取2μL滴于樣品板靶位上，再滴入1.5μL基質溶液覆蓋，在空氣中自然風干；所述的混合液A為含50％v/v乙腈和1％v/v三氟乙酸的水溶液；所述的基質溶液為含10mg芥子酸，0.5mL混合液A和0.5mL蒸餾水的混合溶液。

7.根據權利要求1或3所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的生物標識物為13個核糖體蛋白質，分別為L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14。

8.根據權利要求1所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中，所述的飛行時間質譜測定儀為配備N₂的激光脈沖儀的Axima CFR Plus型飛行時間質譜測定儀，設定條件：m/z為2000-40000Da，氮氣激光脈沖儀λ為337nm，脈沖寬度3ns，頻率10Hz，平均不同位置發射500下激光脈沖，正線性模式。

9.根據權利要求1所述的利用飛行時間質譜鑒別藍藻細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中，將所測圖譜選取范圍為m/z 6000-12000Da，對實際檢測到的峰值，與13個特征核糖體蛋白L32，S21，L33，L35，S18，L29，L31，L28，S16，S19，S15，S20以及S14的理論峰值進行比對后鑒別是否是銅綠微囊藻，同時確定具體株型。