[發明專利]一種提高多聚體蛋白熱穩定性的方法及熱穩定性提高的醇脫氫酶

有效

• 申請號: 201710237756.1
• 申請日: 2017-04-12
• 公開（公告）號: CN108690837B
• 公開（公告）日: 2021-08-17
• 發明（設計）人: 瞿旭東;朱露;馬宏敏;鄧子新
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N9/04
• 分類號: C12N9/04;C12N15/53
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 常海濤

本發明公開了一種提高多聚體蛋白熱穩定性的方法及熱穩定性提高的醇脫氫酶，屬于酶工程技術領域。提高多聚體蛋白熱穩定性的方法為通過在N端相鄰（8?范圍內）的多聚體蛋白的N端和內部亞基接觸界面間引入共價鍵的方式，使多聚體蛋白的各個亞基鏈接起來，形成一個環合的整體。熱穩定性提高的醇脫氫酶的序列分別如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4，這些醇脫氫酶與野生型相比T₅₀¹⁵值分別提高了5.5℃、6.0℃和18℃。本發明避免了現有技術中面臨的篩選工作量大和過程繁瑣等問題，同時通過界面間二硫鍵引入的策略使定點突變更有針對性。

技術領域

本發明屬于酶工程技術領域，具體涉及一種提高多聚體蛋白熱穩定性的方法，以及利用該方法獲得的熱穩定性提高的醇脫氫酶。

背景技術

酶又被看作是功能性蛋白，可以在非常溫和的條件下催化化學反應，并且具有很高的選擇性。因為綠色、經濟和可持續的優點，因此酶在工業應用上備受青睞(U.T.Bornscheuer et al.Nature，2012，485：185-194)。此外，在藥學領域中，一些蛋白如抗體等由于其非常高的選擇性而被廣泛用作疾病治療(R.V.J.Chari etal.Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53：3796-3827)。然而盡管具有很高選擇性和催化活性等優點，蛋白在非生理條件下通常具有較低的穩定性，容易導致失活(R.Fernandez-Lafuente,Enzyme Microb.Tech.，2009，45：405-418)。酶的這種不穩定性的缺點是阻礙其在工業和醫藥應用的最重要因素之一，因此，對蛋白穩定性的改進長期以來一直是一個重點和難點(H.P.Modarresac et al.RSC Adv.，2016，6：115252-115270)。

從結構組成來分，蛋白分為單聚體和多聚體；其中多聚體蛋白由兩個及兩個以上的同源或異源亞基組成。絕大多數情況下，這些亞基是通過亞基接觸界面間的關鍵氨基酸的疏水作用或靜電作用(形成鹽橋)穩定在一起的(H.Yu et al.Biotechnol.Adv.，2014，32：308-315；T.J.Magliery et al.Struct.Biol.，2015，33，161-168)。對于單聚體或多聚體蛋白的單個亞基的穩定性，主要受內部結構柔性和表面靜電相互作用影響。這種缺點可以通過蛋白工程手段增加蛋白骨架結構的剛性或優化表面電荷分布來克服(A.V.Gribenkoet al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2009，106：2601-2606；M.T.Reetz etal.Angew.Chem.Int.Ed.，2006，45：7745-7751)。因此，針對單聚體蛋白，目前的方法主要有向柔性位點或表面靜電位點引入有益突變或通過N-末端和C-末端共價環化主鏈來改善其穩定性(C.Schoene et al.Angew.Chem.Int.Ed.，2014，53：6101-6104)。不同于單聚體蛋白，在多聚體蛋白中，蛋白失活的第一步也是最關鍵的步驟是各個亞基的解離；因此，如何阻止亞基解離是穩定這類復雜蛋白的最關鍵的因素。當前針對穩定多聚體蛋白亞基相互作用的方法，主要集中于向位于蛋白內部的亞基接觸界面間引入有益突變，以增強界面間的相互作用(A.Bosshart et al.Angew.Chem.Int.Ed.，2013，52：9673-9676)。多聚體蛋白由于擁有更多的數量和功能多樣性(如氧化還原和氨基轉移)，對工業和醫藥應用具有更強的吸引力。因此，開發新的有效方法來提高多聚蛋白的穩定性具有非常重要的意義。

蛋白質的末端通常是骨架最靈活的部分，而且容易成為蛋白水解酶的靶點。在單聚體蛋白中，末端的連接被證明能夠顯著提高蛋白質的穩定性。有趣的是，在許多工業上發揮著重要用途的多聚蛋白家族，例如短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)中，它們的每個亞基都是以高度有序的方式結合在一起的，形成多個對稱面；除了內部的亞基界面外，每個亞基的末端都靠的很近形成了一個位于端位的亞基界面，因此理論上可以通過共價鍵的方式將其末端和內部的界面鏈接起來(N.Tanaka et al.Curr.Org.Chem.，2001，5：89-111)。單聚體蛋白由于不存在亞基的解離，因此通常比多聚體蛋白要穩定的多。