[發明專利]一種牛源肌酸激酶同工酶膠體金免疫層析快速檢測試紙條

在審

• 申請號: 201710234074.5
• 申請日: 2017-04-11
• 公開（公告）號: CN107045057A
• 公開（公告）日: 2017-08-15
• 發明（設計）人: 趙世華;楊鼎;達來寶力格;劉威;王根云;蘭儒冰;高娃;楊斌;張月梅;宋越;張帆;戴伶俐;陳偉;宋愛軍
• 申請（專利權）人: 內蒙古自治區農牧業科學院
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/573;G01N33/577
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• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及膠體金免疫層析快速檢測領域，具體涉及一種牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)膠體金免疫層析快速檢測試紙條及方法。

背景技術

近年來我國奶牛業發展十分迅速，然而不孕癥對奶牛養殖業的發展有著重要的影響。大量資料表明，不孕癥占奶牛疾病的20％～30％，子宮內膜炎占不孕癥的40％～60％。引起奶牛子宮內膜炎的病因較多，但主要原因是產后的早期感染所致，有研究表明奶牛產后的早期階段有93％的牛發生子宮感染細菌，到46-60天時感染率降低到39％。

奶牛子宮內膜炎使受精卵不能著床或胚胎早期死亡，延遲了產犢間隔，嚴重影響奶牛的繁殖和生產能力及效率，給奶牛生產造成極大的經濟損失。據資料報道，美國每年有12.19％的奶牛由于不孕癥或繁殖疾病而被淘汰，占淘汰母牛的52.37％，每年因不孕癥損失高達2.7億美元；北京農業大學對北京、南京、上海等16個城市調查，子宮內膜炎占不孕奶牛的68.34％，國內每年淘汰的不孕奶牛占淘汰總數的60％-70％。

肌酸激酶(Creatine Kinase,CK；EC 2.7.3.2)分子量81000～82000Da，是由兩個亞基(M和B)組成的二聚體，可逆催化肌酸與ATP之間的轉磷酰基反應，在肌酸和磷酸肌酸的轉化反應中起著重要的作用。比如在能量代謝最旺盛的肌肉組織和腦組織中，CK的活性是最高的。在內臟器官中，子宮是CK第三活躍的器官，頭兩位是骨骼肌和心肌。根據其同工酶亞基和分布位置的不同，在牛中存在有三種CK同功酶，其中：CK-MM(特異存在于骨骼肌)、CK-MB(特異存在于心肌)和CK-BB(從牛腦中獲得)。以上這些同功酶都存在于細胞質中，Galitzer和Oehme(1985)對牛所有器官的CK進行檢測發現，內臟器官中含有的CK要遠遠少于骨骼肌和心肌，并且大部分的CK屬于同功酶CK-BB。健康牛血清中的CK組成幾乎全部由CK-MM構成，但研究發現在懷孕中和產后婦女、懷孕豚鼠的血清中還存在有可檢測到的CK-BB(腦源或平滑肌源)和CK-MB(Clark et al.,1994)。造成以上現象的原因很有可能是在懷孕后期對能量(新陳代謝)更高的需求(Clark et al.,1994)，即子宮組織在分娩前后對其機械性和新陳代謝有更高的要求(Abramov et al.,1996)。

我們研究表明子宮內膜感染發炎后血清肌酸激酶活性顯著增高，據研究結果其可作為奶牛子宮內膜炎的重要診斷指標。目前，奶牛子宮內膜炎的診斷主要依靠視診、觸診和子宮探針為主的傳統方法，存在早期診斷確診率低和導致植入性病原菌二次感染的問題。因此，迫切需要研究建立一種適用于奶牛子宮內膜炎早期排查的快速、靈敏、經濟適用、操作簡便的現場快速檢測方法。

免疫膠體金技術是一種應用較廣的免疫學方法，該技術是一種將膠體金顆粒與包括抗原、抗體在內的許多蛋白質標記形成免疫金復合物的技術。使用免疫金標技術制備的標記物作為檢測系統中的指示試劑，應用在檢測傳染病、環境污染物、毒品、早孕以及獸醫等領域，這種技術的應用很大程度上提高了體外診斷技術的簡便性和快速性。

在層析材料上發生的免疫反應，具備免疫反應的高特異性、高效率性、高親合性的特點。具體的過程是，含有待測物的樣品溶液通過纖維層析材料的毛細作用沿著層析材料上移，與固定在層析材料上的針對待測物的受體(抗原或抗體)結合發生特性性免疫反應，在些過程中抗原抗體復合物不斷的被積累富集，通過酶反應標記物或直觀可視標記物(如膠體金)使之顯色，從而達到檢測目的物質的目的。

發明內容

本發明根據奶牛子宮內膜炎與血清肌酸激酶活性的正相關性，通過重組表達牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)，制備篩選鼠源單克隆抗體，進一步利用膠體金包被和免疫層析原理研制了一種快速檢測牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)的試紙條，用于田間監測奶牛肌酸激酶同工酶(CK-BB)的變化。

本發明的目的是提供一種牛源肌酸激酶同工酶(CK-BB)膠體金免疫層析快速檢測試紙條及方法，由此快速即時檢測子宮內膜炎，通過膠體金免疫層析定量檢測的方法，檢測牛血清中肌酸激酶同工酶(CK-BB)的濃度，從而用于評估奶牛子宮內膜炎情況，準確，快速，靈敏度高，無需專業人員操作，成本較低，便于推廣使用。