[發(fā)明專利]一種N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201710232811.8
• 申請(qǐng)日: 2017-04-11
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108690867A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-10-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王婷;約瑟夫.弗戈邁爾;劉麗
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/34
• 分類號(hào): C12Q1/34
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責(zé)任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤;杜靜

1.一種N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備：將還原糖標(biāo)準(zhǔn)品稀釋成一系列的濃度標(biāo)準(zhǔn)液，于各濃度標(biāo)準(zhǔn)液中加入三氯乙酸溶液、氫氧化鈉溶液、WST-1顯色溶液，混勻后40-60℃顯色50-60min，使用酶標(biāo)儀在584nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光值，得到還原糖濃度與吸光度關(guān)系曲線；

(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白底物反應(yīng)：將糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品用水稀釋，加熱變性，冷卻后加入pH緩沖液和不同濃度的N-糖酰胺酶反應(yīng)；

(3)N-糖酰胺酶水解糖蛋白產(chǎn)物測(cè)定：步驟(2)N-糖酰胺酶水解糖蛋白反應(yīng)液中加入三氯乙酸溶液終止反應(yīng)，離心取上清液；加入氫氧化鈉溶液，再加入WST-1溶液40-60℃顯色50-60min小時(shí)，使用酶標(biāo)儀在584nm處測(cè)定反應(yīng)液吸光值，反應(yīng)零分鐘為空白對(duì)照；根據(jù)吸光值與還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到N-糖酰胺酶酶解產(chǎn)物濃度，從而計(jì)算酶活性。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)所述還原糖標(biāo)準(zhǔn)品為糖鏈末端具有還原性的糖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)所述一系列的濃度為10μmol/L到200μmol/L之間的任意系列濃度。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)或步驟(3)中的顯色溫度為45-55℃，顯色時(shí)間為60min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)或步驟(3)中的氫氧化鈉溶液的濃度為4-5mol/L，優(yōu)選4mol/L。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(1)或步驟(3)中的三氯乙酸溶液的濃度為2-3mol/L，優(yōu)選2.5mol/L。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(2)中的糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品為辣根過(guò)氧化物酶、核糖核酸酶、雞卵清蛋白、牛胎球蛋白或牛轉(zhuǎn)鐵蛋白。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的N-糖酰胺酶的酶活力測(cè)定方法，其特征在于，步驟(2)中的pH緩沖液為pH 2.6的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液。